结直肠癌组织中脆弱拟杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究

作     者：龚灯梅 

作者单位：遵义医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李吉达

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：产肠毒素脆弱拟杆菌 非产肠毒素脆弱拟杆菌 分离鉴定 全基因组 耐药性 

摘      要：目的:结直肠癌对人类生命健康造成了严重威胁,然而其发病原因及机制并不明确。肠道菌群的失调与结直肠癌的发生发展密切相关,其中脆弱拟杆菌与其高度相关。本研究从结直肠癌患者肿瘤及癌旁组织内进行脆弱拟杆菌的分离,并分别从形态学、生化特性、基因组特征、耐药性及其在体外的促细胞增殖与致炎作用进行分离菌株的生物学特性研究。研究结果将丰富人们对于结直肠癌组织中脆弱拟杆菌的生物学特性的认识,为进一步探究脆弱拟杆菌与结直肠癌的相关性提供新的依据,为结直肠癌发病机制的探究提供新的思路。方法:无菌环境下从组织样本中分离培养脆弱拟杆菌,分别通过形态学、生理生化特性、分子生物学方法对分离到的菌株进行鉴定;提取细菌完整DNA进行分离菌株的基因组完整图测序,获取两株脆弱拟杆菌的全基因组序列,通过生物信息学软件分别进行基因组特征、比较基因组学等生物信息学分析;基于基因组耐药基因特征分析结果,采用肉汤微量稀释法分析菌株的耐药性;应用CCK-8法,分析分离菌株热致死菌体对结直肠癌细胞及正常结直肠基质细胞的细胞增殖影响;联合应用RT-qPCR、ELISA方法,分别以分离菌株的热致死菌体及其分泌的上清为受试对象,分析其与结直肠癌细胞及正常结直肠基质细胞互作过程中对炎性相关因子表达的影响。结果:1.菌株的分离鉴定:形态学观察结果和生化特性鉴定结果发现菌株ZY0302和ZY0804均符合脆弱拟杆菌的形态特征和生化特征。特异性引物的PCR鉴定结果表明来自肿瘤组织内的ZY0302为产肠毒素型脆弱拟杆菌,且为bft-1型;ZY0804为非产肠毒素型脆弱拟杆菌。2.全基因组完整图测序:结果分析表明,菌株ZY0302和ZY0804基因组均由一个闭环染色体组成,其中,ZY0302基因组大小为5141446bp,编码4340个基因,基因平均长度为1041.40bp;ZY0804基因组大小为5174916bp,编码4370个基因,基因平均长度为1048.02bp。KEGG分析显示,耐药性抗菌剂在ZY0302和ZY0804中占比最大。基因功能注释对基因进行ARDB、VFDB数据库比对分析得ZY0302的毒力因子共113种,ZY0804具有毒力因子107种,ZY0302和ZY0804共有毒力基因86个,ZY0302特有毒力基因27个且含bft-1毒力基因,ZY0804特有毒力基因21个;ZY0302有10种抗生素耐药基因,ZY0804有9种抗生素耐药基因,从共有的抗性基因来看,ZY0302和ZY0804具有相同的抗性基因,其中ermF、cepA、VanRA、rosA、mefA、mexF和tet37为二者共有的7种抗性基因,而tetQ、cfxA和dfrA基因仅存在于ZY0302基因中,vat C和Inu A基因仅存在于ZY0804基因中。3.菌株的耐药性实验:肉汤微量稀释法分析结果表明ZY0804、ZY0302对头孢曲松钠、红霉素、多粘菌素B、盐酸卡那霉素、盐酸克林霉素、硫酸链霉素、磺胺-5-甲氧嘧啶具有较高的耐药性。与ZY0302相比,ZY0804对氨苄青霉素、青霉素G钠盐、头孢西丁、万古霉素盐酸盐、甲硝唑、环丙沙星盐酸盐更敏感;与ZY0804相比,ZY0302对氯霉素更敏感。4.细胞增殖实验:结果表明,同一时间不同浓度的ZY0302热致死菌体对HT-29细胞的细胞增殖作用有一定的浓度依赖性,即高浓度促进细胞增殖,低浓度抑制细胞增殖;同一浓度的ZY0302热致死菌体与HT-29细胞作用,随着时间的延长,HT-29细胞的细胞增殖被抑制;同一时间不同浓度ZY0302热致死菌体对NCM460细胞作用短时间内细胞毒性作用明显,低浓度(3.4385×10CFU/mL)的ZY0302致死菌体与NCM460细胞作用,随着时间的延长,NCM460细胞的增殖表现为促进作用;同一时间不同浓度的ZY0804热致死菌体对HT-29细胞的作用有一定的浓度依赖性,即高浓度促进细胞增殖,低浓度(5.5×10CFU/mL)ZY0804热致死菌体与HT-29细胞作用,HT-29细胞的细胞活力随着时间的延长被促进;ZY0804热致死菌体作用NCM460细胞后对细胞活力呈现促进作用,低浓度菌体对细胞增殖作用更明显。5.细胞因子监测:结果表明,HT-29细胞中所有实验组的细胞中未检测到细胞因子IL-6转录水平或蛋白水平的表达,在NCM460细胞的两个实验中我们均检测到IL-6转录水平或蛋白水平的表达,结合两个实验,12 hpi-36 hpi内,实验组相较于对照组有促进IL-6分泌表达的作用;ZY0302热致死菌体和ZY0804上清促进HT-29和NCM460细胞中IL-8的表达;实时荧光定量PCR结果显示,ZY0302和ZY0804热致死菌体及其上清分别作用HT-29细