LncRNA NONMMUT040834在心肌细胞坏死和心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制研究

作     者：于雪 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王昆;刘翠云

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：长链非编码RNA 心肌缺血再灌注损伤 心肌梗死 心肌细胞坏死 

摘      要：目的急性心肌梗死是由急性冠状动脉闭塞引起的,在世界范围内具有高发病率、致死率和致残率的特征。急性心肌梗死会导致心肌细胞大量死亡,造成不可逆的心脏损伤,而细胞坏死是急性心肌梗死中细胞死亡的主要形式之一。细胞坏死的可调控性是近年来才被揭示的,其调控机制尚未被完全揭示。心肌细胞程序性坏死在急性心肌梗死中的作用机制已经被大量报道,抑制心肌梗死中心肌细胞坏死成为了新的心肌保护策略。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200 nt的非编码RNA,广泛参与细胞内多种病理生理过程,在癌症、神经疾病、免疫性疾病、心血管等疾病中都有重要调控作用,其在心肌梗死中的调控作用也已经被报道。本研究通过构建心肌细胞坏死模型,筛选在心肌细胞坏死中发挥调控作用的新的lncRNA,探讨lncRNA在缺血/再灌注(ischemic/reperfusion,I/R)中的具体作用和分子机制,丰富lncRNA调控细胞坏死机制的理论,为心肌缺血/再灌注损伤的预防和治疗提供新的思路。方法1、碘化丙啶(propyl iodide,PI)染色筛选HO诱导小鼠心肌细胞HL-1坏死的适宜浓度和时间,构建细胞坏死模型。收集RNA,lncRNA测序,通过测序数据及实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)筛选差异表达lncRNA。2、通过冠状动脉左前降支结扎构建小鼠心肌梗死模型,qRT-PCR检测梗死后lncRNA、坏死标志基因,以及相关基因在转录水平的表达情况,免疫印迹(Western blot,WB)检测相关基因在蛋白水平上的表达情况。3、构建lncRNA敲低腺病毒载体,通过病毒感染细胞实验验证lncRNA在细胞坏死中的作用。检测内容包括qRT-PCR检测腺病毒敲低效果,PI染色检测lncRNA敲低后HO诱导心肌细胞坏死情况,WB检测lncRNA敲低后坏死标志物的表达情况。4、构建lncRNA过表达腺病毒载体,通过qRT-PCR检测腺病毒过表达效果,PI染色检测过表达lncRNA后,HO诱导心肌细胞坏死情况,WB检测lncRNA过表达后细胞坏死标志物的表达情况。5、小鼠尾静脉注射lncRNA敲低腺病毒后,构建小鼠I/R模型,验证lncRNA在心肌梗死中的作用。qRT-PCR检测小鼠注射lncRNA敲低腺病毒后的基因变化情况,WB检测小鼠注射lncRNA敲低腺病毒后的蛋白表达情况,Evans Blue/TTC双染色观察小鼠心肌梗死面积,小鼠M型超声心动测量心功能损伤情况。6、小鼠尾静脉注射lncRNA过表达腺病毒后,qRT-PCR检测小鼠注射lncRNA过表达腺病毒后的基因变化情况,WB检测小鼠注射lncRNA过表达腺病毒后的蛋白表达情况,Evans Blue/TTC双染色观察小鼠心肌梗死面积,小鼠M型超声心动测量心功能损伤情况。7、catRAPID网站预测lncRNA下游靶蛋白,通过分析及WB验证,初步筛选出ZMYND8作为lncRNA下游靶蛋白,RIP实验进一步鉴定lncRNA与下游靶蛋白间存在相互作用。8、构建靶蛋白si RNA转染HL-1,qRT-PCR检测转染si RNA的转染效率,WB检测转染si RNA后,细胞内ZMYND8、RIPK3、p-RIPK3的蛋白表达,PI染色观测靶蛋白敲低后,HO诱导细胞坏死情况。结果1、PI染色筛选出HO诱导心肌细胞坏死最适处理时间为6 h,最适浓度为600μM。WB验证细胞坏死标志蛋白RIPK3、p-RIPK3在6 h、600μM HO诱导的细胞中蛋白表达水平显著上调;2、qRT-PCR筛选鉴定心肌细胞坏死模型中差异表达的lncRNA,发现lncRNA NONMMUT044(以下简称为lnc4)在心肌细胞坏死中表达上调;3、构建lnc4过表达腺病毒,PI染色结果显示lnc4过表达后,HO诱导的细胞坏死数量明显增加。Evans Blue/TTC双染色和小鼠超声心动测量结果表明过表达lnc4会加重I/R造成的心肌梗死面积,加剧心功能损伤;4、构建lnc4敲低腺病毒,PI染色结果显示lnc4敲低后,HO诱导的HL-1细胞坏死数量显著减少。Evans Blue/TTC双染色和小鼠超声心动测量结果表明,尾静脉注射lnc4敲低腺病毒减少了小鼠I/R后导致的心肌梗死面积,降低了小鼠的心功能损伤;5、catRAPID网站对lnc4下游蛋白进行预测,筛选鉴定出ZMYND8在心肌细胞坏死中表达上调。WB验证ZMYND8在蛋白水平上的表达与lnc4成正相关,其表达水平随lnc4过表达而上调。同时发现,在HO诱导的心肌细胞坏死中,ZMYND8在蛋白水平表达增加。RIP实验进一步确认ZMYND8与lnc4间存在相互作用;6、HL-1转染ZMYND8-si RNA后,