小贯小绿叶蝉EonuIR25a、EonuGR1基因克隆及嗅觉功能验证

作     者：张瑞瑞 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张正群;徐秀秀

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：小贯小绿叶蝉 受体 基因克隆 表达特性 嗅觉功能 

摘      要：小贯小绿叶蝉[Empoasca(Matsumurasca)onukii Matsuda]是危害茶树的重要害虫,目前对于小贯小绿叶蝉的主要防治手段是化学防控。然而,过度使用农药造成严重的农药残留,危害人类身体健康的同时也造成环境污染问题。昆虫依靠嗅觉系统进行寄主定位、觅食、产卵等生理活动,多种嗅觉相关受体参与昆虫的嗅觉识别过程,包括嗅觉受体(Odorant receptors,ORs)、离子型受体(Ionotropic receptors,IRs)、味觉受体(Gustatory receptors,GRs)等。目前,大多数关于昆虫嗅觉受体基因的研究仅停留在鉴定方面,嗅觉相关基因功能探索对于进一步利用分子手段防治害虫具有重要意义。本研究对小贯小绿叶蝉嗅觉相关受体Eonu IR25a和Eonu GR1序列进行克隆,利用q RT-PCR对小贯小绿叶蝉雌雄虫不同组织内的基因表达量进行分析,通过RNA干扰技术和行为学试验验证Eonu IR25a和Eonu GR1干扰前后小贯小绿叶蝉对茶树挥发物的行为趋性变化差异。研究嗅觉相关受体基因在叶蝉识别茶树挥发物中功能为针对性研发行为调控剂用于小贯小绿叶蝉生态防治奠定基础。本研究主要结果如下:1.通过阳性克隆小贯小绿叶蝉Eonu IR25a和Eonu GR1并通过序列分析可知,Eonu IR25a的开放阅读框长度为1266 bp,共编码422个氨基酸,蛋白分子量为48.87k D。Eonu IR25a蛋白具有4个跨膜域,包含Lig＿chan(41-350位)和SBP＿bac＿3(1-317位)保守结构域,理论等电点为6.50,属于亲水性蛋白;Eonu GR1的开放阅读框长度为1066 bp,编码354个氨基酸,蛋白分子量为40.51 k D。Eonu GR1蛋白具有4个跨膜域,包含7tm＿7保守结构域(1-346位),理论等电点为9.33,属于疏水性蛋白。2.q RT-PCR结果表明,Eonu IR25a在雌雄成虫触角的表达量显著高于其它身体组织,在雌性足部的基因表达量最少。Eonu IR25a在雌触角中的表达量是雌成虫足部和胸部的4-7倍。Eonu IR25a基因在雌雄成虫触角中的表达量无差异,在不同组织之间存在极显著差异。Eonu GR1在雌成虫腹部的表达量显著高于其他组织,表达量是雌成虫足部和触角的21.3倍和2.7倍,其在成虫腹部表达量约是头部和胸部的7倍左右,Eonu GR1在不同组织之间存在极显著差异。3.多重序列比对和系统进化树结果表明,Eonu IR25a与草翅叶蝉Hvit IR25a和Hvit IR25a-like聚集在最小的分支中,Eonu IR25a其他半翅目昆虫IRs的序列相似度在30-40%之间,其与Hvit IR25a序列相似度为36.52%。Eonu GR1其他半翅目昆虫GRs的序列相似度在15-20%之间,Eonu GR1与Hvit GR1的序列相似度为17.14%。Eonu GR1与部分半翅目昆虫的GR22和GR63a聚为一支。4.田间和室内结果表明,苯乙醇对小贯小绿叶蝉具有吸引作用。RNAi结果表明干扰后Eonu IR25a、Eonu GR1基因3 h干扰效率最高,靶标基因的相对表达量最低,浸根处理的干扰效率比喷雾处理的明显并且效果稳定。干扰Eonu IR25a后,叶蝉对0.1、10和100μL/m L苯乙醇的反应率下降,反应率分别为26.67%、30%和30%,推测Eonu IR25a可能在小贯小绿叶蝉识别茶树挥发物苯乙醇中发挥作用。叶蝉对10、100μL/m L苯乙醛的反应明显下降,反应率均为30%,推测小贯小绿叶蝉Eonu GR1可能参与识别苯乙醛的过程。