miR-29c-5p通过靶向INHBA调控水牛卵泡颗粒细胞功能状态的研究

作     者：程佳瑞 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邓彦飞

授予年度：2023年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：miR-29c-5p INHBA 水牛颗粒细胞 卵泡闭锁 激活素A 抑制素A 

摘      要：卵泡颗粒细胞是卵泡中重要的功能细胞,其凋亡、增殖和类固醇激素分泌等功能状态的变化与卵泡发育密切相关。microRNA(miRNA)是一类小非编码RNA分子,广泛参与颗粒细胞凋亡、增殖、自噬、类固醇激素合成等多种生理过程。根据前期水牛健康与闭锁卵泡颗粒细胞高通量测序发现miR-29c-5p在水牛闭锁卵泡中高表达,提示其可能参与调控水牛卵泡闭锁。本试验运用qRT-PCR、Western blot、ELISA、流式细胞术、EdU等技术,结合基因过表达、干扰以及共转染等方法,探讨miR-29c-5p及其靶基因调控水牛卵泡颗粒细胞功能状态的机理,为深入研究水牛卵泡发育、闭锁的调控机制,提高水牛繁殖效率提供理论基础。1、miR-29c-5p调控水牛卵泡颗粒细胞功能状态研究miR-29c-5p对水牛颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素合成功能的影响。结果表明,miR-29c-5p在水牛闭锁卵泡颗粒细胞中的表达量高于健康卵泡(P0.01)。颗粒细胞中转染miR-29c-5p mimics(mimics)与miR-29c-5p inhibitor(inhibitor),EdU、流式细胞术、ELISA 等研究表明,mimics能显著抑制水牛颗粒细胞增殖(P0.05),促进细胞凋亡(P0.01),并抑制类固醇激素雌二醇(Estradiol,E2)和孕酮(Progesterone,PROG)的分泌(P0.01);qRT-PCR与Western blot结果显示增殖、凋亡及类固醇激素合成相关基因相对表达量的变化与细胞表型变化一致;而inhibitor处理后的结果与mimics结果相反。2、miR-29c-5p通过靶向INHBA基因调控水牛卵泡颗粒细胞功能状态。生物信息学分析、qRT-PCR、双荧光素酶报告实验检测结果表明,INHBA是miR-29c-5p的靶基因;过表达INHBA显著促进水牛卵泡颗粒细胞增殖,抑制细胞凋亡,并显著促进类固醇激素E2与PROG的分泌(P0.01);增殖、凋亡、类固醇激素合成相关基因的相对表达量变化与细胞表型变化一致。共转染miR-29c-5p mimics与INHBA过表达载体,结果显示,INHBA逆转了 miR-29c-5p对水牛颗粒细胞功能状态的调控作用,进一步表明miR-29c-5p通过靶基因INHBA调控水牛颗粒细胞的功能状态。3、初步探讨INHBA调控水牛卵泡颗粒细胞功能状态的作用机理。INHBA编码的βA亚基是激活素A(ActivinA,ACV-A)和抑制素A(InhibinA,INH-A)的组成部分。进一步验证INHBA是否通过增加激活素A和抑制素A的分泌,进而调节水牛卵泡颗粒细胞功能状态。结果表明,miR-29c-5p mimics显著减少体外培养的水牛卵泡颗粒细胞激活素A和抑制素A的分泌,而INHBA的过表达显著增加激活素A和抑制素A的分泌(P0.01)。不同浓度(0、1、10、100 ng/mL)的激活素A和抑制素A重组蛋白处理水牛颗粒细胞,发现激活素A(10、100 ng/mL)和抑制素A(100ng/mL)促进水牛颗粒细胞增殖、抑制细胞凋亡,并提高增殖、抑凋亡和类固醇激素合成相关基因的表达,降低促凋亡相关基因的表达(P0.05)。以上结果表明:miR-29c-5p通过靶向INHBA基因促进水牛卵泡颗粒细胞凋亡、抑制增殖和类固醇激素E2、PROG合成;INHBA基因通过促进激活素A和抑制素A的产生进而调控水牛卵泡颗粒细胞功能状态。