GPX8调控猪骨骼肌卫星细胞成肌分化的作用研究

作     者：王育禾 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李晓

授予年度：2023年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：GPX8 成肌分化 猪 骨骼肌卫星细胞 

摘      要：骨骼肌作为机体最大的组织器官,占体成分的40-60%,是机体主要的能量代谢器官。猪是最重要的牲畜之一,猪肉是人类饮食中蛋白质的主要来源,其骨骼肌的生长发育与肉质和产肉量密切相关,同时骨骼肌的生长发育过程也受到多种因素的影响。骨骼肌的发育过程主要包括肌细胞的增殖、迁移、分化、融合形成肌管,进而成熟形成肌纤维。不同的肌纤维类型线粒体数量、代谢类型均不相同,在不同的营养及环境条件下可发生相互转化,导致肉色、p H值、嫩度和营养价值发生改变,因此肌纤维类型是影响肉质的关键因素。谷胱甘肽过氧化物酶8(Glutathione peroxidase 8,GPX8)是谷胱甘肽过氧化物酶家族的成员,已有的研究主要集中在癌症方面。猪GWAS研究发现GPX8基因变异是与产肉量等经济性状显著相关,所以本研究猜测其可能是与肌肉发育相关的调控因子。本研究以猪骨骼肌卫星细胞为研究对象,通过干扰和过表达探究GPX8在猪骨骼肌卫星细胞成肌分化中的作用;并通过质谱初步筛选出结合蛋白,以此对下游机制进行探究。主要获得以下结果:***8在猪骨骼肌中高表达,在骨骼肌卫星细胞增殖期与分化期的表达均呈下降趋势通过对在线公布的RNA-seq数据分析,发现GPX8的表达与猪生长速度、成肌分化及肌纤维类型有关。RT-q PCR分析发现,GPX8在猪骨骼肌中高表达,且在猪骨骼肌卫星细胞增殖期表达逐渐下降,并随着成肌分化表达逐渐下降。***8促进猪骨骼肌卫星细胞增殖与对照组相比,转染GPX8 si-RNA显著抑制了猪骨骼肌卫星细胞S期细胞数量,降低了Ed U阳性细胞比例,同时抑制增殖正调控相关基因Cyclin E、Cyclin D m RNA和蛋白的表达水平,显著增加增殖负调控相关基因p21的表达水平。过表达GPX8的结果相反。***8抑制猪骨骼肌卫星细胞分化干扰GPX8显著增加了My HC阳性细胞数量,增加分化指数及分化相关标志基因My HC、My OD、My OG的m RNA和蛋白表达水平。过表达结果进行了反向验证。***8促进慢肌肌管的形成,抑制快肌肌管的形成GPX8在猪慢肌SOL中的表达高于快肌LD,并且干扰GPX8之后Fast-My HC肌管形成增加,Slow-My HC肌管形成减少。另外干扰GPX8之后,线粒体数目减少,形态发生固缩,同时ATP水平降低,线粒体拷贝数减少,线粒体相关蛋白ATP5A、MTCO1、UQCRC2、SDHB、NDUFB8表达下降。过表达GPX8得到了相反的结果。***8抑制猪骨骼肌卫星细胞成肌分化依赖于TMD结构域活性通过构建GPX8 TMD结构域突变载体,将TMD结构域中的保守氨基酸Cys28突变为Ala,Cys79突变为Ser,发现突变之后,My HC阳性细胞增多,分化指数升高,与分化相关的标志基因My HC、My OD、My OG m RNA和蛋白表达均升高,说明TMD结构域突变之后,GPX8对猪骨骼肌卫星细胞成肌分化的抑制作用得到恢复。质谱初步鉴定GPX8互作蛋白主要富集在代谢和运动神经元等肌肉相关信号通路中,并将LRPPRC、NAA15、EIF3M等可能的互作蛋白进行了初步筛选。综上所述,本研究在细胞水平上揭示GPX8在猪骨骼肌卫星细胞成肌分化中的调节作用,初步确定了GPX8调控猪骨骼肌卫星细胞成肌分化的功能,为肉品质的遗传改良提供了新的靶点。