多组学分析对原发性冻结肩发病机制的探索

作     者：傅夏威 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：汪滋民

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：原发性冻结肩 多组学 瓜氨酸化 肌肉发育 免疫反应 

摘      要：目的原发性冻结肩(Primary Frozen Shoulder,PFS)是最常见的肩关节疾病之一,主要临床症状为肩关节疼痛与活动受限,发病率约为2%-5%。据统计,PFS是上下肢关节纤维化中发生率最高,需要手术介入治疗最多的关节纤维化疾病,每年需耗费大量的医疗资源。PFS治疗以保守治疗(皮质醇注射、理疗、麻醉下松解等)为主,但仍有相当一部分患者在治疗后遗留肩关节疼痛及活动受限等症状,给日常生活带来极大的不便。PFS的具体发病机制仍不明确,炎症、免疫及纤维化反应等多因素参与疾病的发生进展,导致部分患者治疗效果不佳。因此,对PFS发病机制的探索及寻找针对病因的治疗方法具有重要的意义。随着内镜技术的发展,关节镜下松解治疗PFS应用的越来越为广泛,手术松解能在短期内快速恢复原先的活动范围及缓解疼痛。然而对于手术时机的选择,目前还没有达成明确的共识,缺乏具有代表性的分子标志物来反应疾病的严重程度及决定手术时机。基于以上原因,本研究通过对PFS患者及相应对照患者的组织与血液样本进行多组学分析,以期探索PFS发病的具体机制及筛选相关的分子标志物。方法本研究招募符合相应入组标准的受试者,根据肩关节活动范围分为重度组(PFS患者)、轻度组(肩袖损伤合并肩关节僵硬患者)与对照组(肩关节脱位等非关节僵硬患者)。分别采集三组患者的组织样本与血液样本,进行转录组测序、代谢组及修饰组串联质谱分析,利用多组学联合分析在基因表达-代谢物-翻译后修饰三个层面上探索PFS发病机制,并筛选潜在的分子标志物。结果本研究共招募30例受试者,其中重度组13例,轻度组12例,对照组5例,另外还抽取了10例健康志愿者的血液样本。通过代谢组学分析,我们发现重度组组织样本中脂质代谢及氨基酸代谢显著失调,瓜氨酸相关通路与冻结肩发生进展联系紧密。对血浆样本的代谢组学分析筛选得到了两个磷脂分子(SOPC、PC16:0)可以作为区分轻重度冻结肩的分子标志物。在转录组分析中,肌肉发育与肌肉收缩相关的通路被发现在重度组中显著激活。代谢组学联合转录组学分析发现精氨酸-瓜氨酸相关通路在重度组中显著上调,免疫组化染色验证了催化瓜氨酸产生的两种酶:一氧化氮合酶1(Nitric Oxide Synthase 1,NOS1)与肽基精氨酸脱亚胺酶Ⅱ(Peptidyl Arginine Deiminase Type Ⅱ,PADI2)在重度组中高表达。对转录组数据的免疫浸润分析发现T细胞、B淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、CD8T细胞等免疫细胞在重度组组织样本中浸润明显,提示蛋白质瓜氨酸化与免疫反应共同作用影响冻结肩的发生进展。修饰组学分析证实重度组中存在明显的蛋白质瓜氨酸化修饰上调,并用免疫荧光染色进行了验证。对差异修饰位点的富集分析结果与转录组学相符合,肌肉发育与肌肉收缩相关的通路在重度组中显著激活。将修饰组数据与转录组数据进行联合分析,发现在重度组组织中三个蛋白(MYH6、TTN、ITIH4)的基因表达水平与瓜氨酸化修饰水平均上调,蛋白互作网络分析表明这三个瓜氨酸化蛋白互相作用与冻结肩进展密切相关。结论重度冻结肩组织中脂质代谢及氨基酸代谢显著失调,肌肉发育与肌肉收缩相关通路被高度激活。两种磷脂(SOPC、PC16:0)可以作为区分轻重度冻结肩的潜在分子标志物。PADI2催化蛋白质瓜氨酸化在重度组样本中显著上调,这一过程与免疫反应密切相关;三种瓜氨酸化蛋白(MYH6、TTN、ITIH4)互相作用影响冻结肩的发生进展。未来仍需更多研究来探索瓜氨酸化修饰与免疫反应及疾病表型之间的关系。