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高强度炎症反应诱导关节软骨特异性瓜氨酸化抗原表达

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南方医科大学学报 2020年第8期40卷 1081-1089页

作者：覃桂城林晓吟梁培彬李艳鹏周春 Kutty Selva Nandakumar Rikard Holmdahl 南方医科大学药学院SMU-KI联合医学炎症中心广东广州510515 瑞典卡罗林斯卡医学院医学生物化学和生物物理学系医学炎症研究所瑞典斯德哥尔摩SE-17177

目的探讨关节软骨蛋白瓜氨酸表位的表达情况,以及瓜氨酸化表位对抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPAs)的免疫应答的影响。方法体外诱导实验:实验组加不同浓度梯度的脂多糖、热灭活细菌(大肠杆菌、金色葡萄球菌)或二型胶原(CII)特异性单克隆抗体等不... 详细信息

目的探讨关节软骨蛋白瓜氨酸表位的表达情况,以及瓜氨酸化表位对抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPAs)的免疫应答的影响。方法体外诱导实验:实验组加不同浓度梯度的脂多糖、热灭活细菌(大肠杆菌、金色葡萄球菌)或二型胶原(CII)特异性单克隆抗体等不同刺激物诱导体外培养关节软骨蛋白瓜氨酸化,等量PBS作为对照组,利用特异性结合瓜氨酸化表位的单克隆抗体ACC4(IgG1)进行免疫组织化学染色,ACC1(IgG2a)作为阳性对照,Hy2.15(IgG1)和L243(IgG2a)分别作为同型阴性对照,显微镜下观察瓜氨酸化蛋白表达;体内诱导实验:SD大鼠右膝关节内注射不同浓度脂多糖作为实验组,左膝关节内注射等量PBS为对照组,3 d后取膝关节组织,制成冰冻切片,利用上述抗体进行免疫组化染色,显微镜下观察瓜氨酸化蛋白表达;建立不同种系的胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠模型,评价其疾病发生率和严重程度,同时收集小鼠血清与高滴度抗瓜氨酸化抗体的类风湿性关节炎患者血清,采用液相芯片技术检测小鼠及类风湿患者血清中抗瓜氨酸化蛋白抗体水平,并用免疫组织化学检测关节炎小鼠关节软骨瓜氨酸化蛋白的表达水平。结果特异性结合瓜氨酸化CII表位的ACC4抗体未能结合至经不同诱导的关节软骨组织;与健康对照组相比,ACC4抗体和含高滴度的抗瓜氨酸化蛋白抗体的类风湿性关节炎患者血清中的抗体均能结合至CIA小鼠关节炎症关节软骨周围的滑膜组织;成功构建不同种系小鼠类风湿性关节炎模型,其发病率和疾病严重程度无统计学差异(P>0.05);液相芯片技术分析结果显示,小鼠血清中的抗瓜氨酸化抗体低表达或几乎不表达,但抗CII三螺旋结构多肽的抗体反应性较强。结论轻度急性炎症反应不足以引起关节软骨蛋白瓜氨酸化,其特异性抗原表位的表达需要高强度的炎症反应。二型胶原诱导的小鼠关节炎模型中炎症关节软骨蛋白可表达瓜氨酸化抗原表位,但瓜氨酸化抗原表位的表达不足以引起小鼠体内抗瓜氨酸化抗体的免疫应答,其免疫应答需要更多的刺激信号来诱导。

关键词：类风湿关节炎瓜氨酸化抗瓜氨酸化蛋白抗体二型胶原蛋白胶原诱导关节炎

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瓜氨酸化在多发性硬化中的机制探究

中国免疫学杂志 2018年第11期34卷 1753-1755,1761页

作者：张新燕孙梦娇原铂尧孙静洁王满侠兰州大学第二医院兰州730000

多发性硬化(MS)是全球分布的中枢神经系统(CNS)自身免疫性脱髓鞘疾病,目前认为其发病是基因易感性与环境因素双重作用的结果。瓜氨酸化是一种可在正常代谢中观察到的转录后修饰,但是异常的瓜氨酸化可以转变自身抗原表位而激发自身免疫... 详细信息

多发性硬化(MS)是全球分布的中枢神经系统(CNS)自身免疫性脱髓鞘疾病,目前认为其发病是基因易感性与环境因素双重作用的结果。瓜氨酸化是一种可在正常代谢中观察到的转录后修饰,但是异常的瓜氨酸化可以转变自身抗原表位而激发自身免疫异常导致的自身免疫性疾病。近期关于EB病毒(EB)感染与自噬在多发性硬化发病机制相关联系的研究中发现抗原瓜氨酸化在免疫异常触发中的重要作用。本文就瓜氨酸化在多发性硬化病理机制中的作用进行综述,以期了解二者相互联系的意义。

关键词：多发性硬化瓜氨酸化 EB病毒自噬

瓜氨酸化α-烯醇化酶特异性单克隆抗体制备及其在阿尔茨海默病动物模型中的检测应用

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现代免疫学 2017年第3期37卷 206-211页

作者：韩魏巍胡梦蝶苏伊玲邓灵福袁永泽杨洋熊丽刘徳立耿辉华中师范大学生命科学学院湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室武汉430079

本研究利用杂交瘤技术制备瓜氨酸化α-烯醇化酶特异性单克隆抗体,并探究瓜氨酸化α-烯醇化酶抗体在检测阿尔茨海默病(AD)动物模型中的作用。利用生物信息学软件分析预测α-烯醇化酶的B细胞优势表位,选取~9R-^(25)F位氨基酸序列,将该表... 详细信息

本研究利用杂交瘤技术制备瓜氨酸化α-烯醇化酶特异性单克隆抗体,并探究瓜氨酸化α-烯醇化酶抗体在检测阿尔茨海默病(AD)动物模型中的作用。利用生物信息学软件分析预测α-烯醇化酶的B细胞优势表位,选取~9R-^(25)F位氨基酸序列,将该表位多肽中2个精氨酸替换为瓜氨酸,化学合成瓜氨酸化α-烯醇化酶~9R-^(25)F多肽(citrullinatedα-enolase peptide,CEP)。采取活泼酯法将CEP多肽与BSA偶联制备CEP-BSA偶联抗原并免疫BALB/c小鼠,杂交瘤技术制备CEP单克隆抗体。免疫组织化学和Western blotting对其特异性进行验证。CEP-BSA偶联抗原免疫小鼠能诱发特异性抗体反应,经细胞融合、筛选得到一株稳定分泌CEP特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为9B5。Western blotting分析显示该单克隆抗体能特异性结合瓜氨酸化α-烯醇化酶,免疫组织化学检测显示9B5单抗能结合AD模型大鼠脑组织细胞上瓜氨酸化的α-烯醇化酶。本研究成功制备的瓜氨酸化α-烯醇化酶特异性单克隆抗体将有助于进一步研究瓜氨酸化α-烯醇化酶在相关疾病发病中的作用。

关键词：抗原优势表位瓜氨酸化 α-烯醇化酶单克隆抗体

瓜氨酸化波形蛋白对类风湿关节炎患者外周血来源树突状细胞的干预作用

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中华风湿病学杂志 2011年第12期15卷 834-838,I0001页

作者：宗明张慧孙立山金中淦范列英上海市东方医院检验科 200120 上海市临床检验中心

目的探讨波形蛋白瓜氨酸化前后在体外对类风湿关节炎（RA）患者外周血来源树突状细胞（DCs）的细胞形态、表型和功能的影响。方法分离外周血单个核细胞（PBMCs），粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）和白细胞介素（IL）-4体外培... 详细信息

目的探讨波形蛋白瓜氨酸化前后在体外对类风湿关节炎（RA）患者外周血来源树突状细胞（DCs）的细胞形态、表型和功能的影响。方法分离外周血单个核细胞（PBMCs），粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）和白细胞介素（IL）-4体外培养制备未成熟DCs（imDCs），分别用脂多糖、瓜氨酸化波形蛋白（cVim）和波形蛋白刺激培养的imDCs，磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照，流式细胞仪检测DCs表面标志CD14、CD80、CD83、CD86、主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ、MHCⅡ表达变化。将实验组获得的DCs和同种异体T细胞进行混合淋巴细胞反应，通过单溶液细胞增殖分析（MTS）法检测T细胞的增殖情况。采用t检验。结果以阴性对照组imDCs的各个免疫表型阳性率作为1，脂多糖能显著诱导RA—imDCs表面MHCII、CD80、CD83、CD86表达（1．07±0．14，1．25±0．13，1．90±1．08，2．44±0．65，P均〈O．05）；cVim诱导MHCⅡ（1．18±0．09）、CDS3（1．97±0．99）表达水平上调（P〈0．05，P〈0．01）；波形蛋白对MHCⅡ及CD83、CD86表达无影响（0．95±0．11，0．90±0．29，1．04±0．06），仅抑制CD80表达（0．82±0．18，P〈0．01）。与脂多糖组相比，cVim组的MHCII表达水平显著增高（P〈O．05），而CDS0、CD86（0．83±0．36、1．32±0．15）的表达水平则低于脂多糖组（P〈0．01，P〈0．05）；eVim组MHCⅡ和CD83的表达水平显著高于波形蛋白组（P均〈O．05）。混合淋巴细胞反应显示经脂多糖和cVim诱生的DCs对同种异体T细胞具有明显刺激增殖作用，且随着DCs细胞浓度的增加而作用增强；波形蛋白诱生的DCs则无刺激增殖作用。结论cVim可诱导imDCs成熟，并且能够提高细胞表面共刺激分子的表达。

关键词：波形蛋白树突细胞关节炎类风湿瓜氨酸化

抗瓜氨酸化葡萄糖-6-磷酸异构酶多肽抗体的检测及其在类风湿关节炎中的意义

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北京大学学报（医学版） 2016年第6期48卷 937-941页

作者：武东孙琳李常虹杨麟赵金霞刘湘源北京大学第三医院风湿免疫科北京100191

目的：检测类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者血清中抗瓜氨酸化葡萄糖-6-磷酸异构酶（citrullinated glucose-6-phosphate isomerase,C-GPI）70～88肽抗体（抗C-GPI70- 88抗体）和抗C-GPI435～453肽抗体（抗CGPI435～453抗体）的水平,同时检测其原型多肽抗体水平,评价抗C-GPI多肽抗体在RA诊断中的价值。方法：应用酶联免疫吸附法检测191例RA患者、129例其他风湿免疫疾病患者和74例健康对照组血清中抗C-GPI70- 88抗体、抗C-GPI435～453抗体、抗GPI70～88抗体和抗GPI435～453抗体的水平,并收集RA患者临床和实验室检查数据,分析抗CGPI多肽抗体在RA诊断中的价值以及与临床和实验室指标的相关性。结果：（1）RA组抗C-GPI70～88抗体和抗CGPI435～453抗体的滴度（68.71±4.20和51.78±3.13）显著高于疾病对照组和健康对照组（P〈0.05）,而抗GPI70-88抗体和抗GPI435～453抗体的滴度在各组中差异无统计学意义。（2）抗C-GPI70- 88抗体在RA诊断中的敏感性为41.88%,特异性为84.50%;抗C-GPI435～453抗体在RA诊断中的敏感性为46.05%,特异性为86.05%;联合检测两种抗瓜氨酸化多肽抗体的敏感性为50.79%,特异性为86.05%。（3）抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体在类风湿因子、抗角蛋白抗体、抗环瓜氨酸肽抗体均阴性的RA患者中的阳性率分别为35.00%和45.00%。（4）RA患者抗C-GPI70～88抗体和抗C-GPI435～453抗体阳性组和阴性组之间临床和实验室指标差异无统计学意义。结论：RA患者体内可以检测到抗C-GPI多肽抗体,C-GPI可能参与了RA的发病,对于血清阴性的RA患者有较好的诊断价值。

关键词：关节炎,类风湿瓜氨酸化葡萄糖-6-磷酸异构酶

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筛选肿瘤细胞中的瓜氨酸化蛋白

中华肿瘤杂志 2015年第3期37卷 165-169页

作者：张伟马立宁隋赟常晓天山东省济南市第二人民医院内科 250001 山东省千佛山医院医学研究中心

目的：筛选肿瘤细胞中的瓜氨酸化蛋白。方法培养食管癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌和胃癌细胞系，用2张相同凝胶在相同条件下对肿瘤细胞系中提取的蛋白进行二维电泳（2－DE）分析；将其中1张2－DE凝胶... 详细信息

目的：筛选肿瘤细胞中的瓜氨酸化蛋白。方法培养食管癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌和胃癌细胞系，用2张相同凝胶在相同条件下对肿瘤细胞系中提取的蛋白进行二维电泳（2－DE）分析；将其中1张2－DE凝胶上的蛋白印迹转印至聚偏氟乙烯膜上，用抗瓜氨酸抗体杂交后检测免疫信号。将二维蛋白质印迹法（2－D WB）结果与另外1张2－DE蛋白图谱进行对比，将显示瓜氨酸免疫信号的蛋白从第2张2－DE凝胶中收集并进行质谱鉴定，以确定瓜氨酸蛋白。用免疫共沉淀法验证各肿瘤细胞系中瓜氨酸化蛋白的表达。结果2－DWB和质谱分析结果显示，培养的肿瘤细胞系中存在瓜氨酸化的α－烯醇化酶（ ENO1）、热休克蛋白60（ HSP60）、细胞角蛋白8（KRT8）、微管蛋白β（TUBB）、T细胞受体β链（TCRβ）、波形蛋白和蛋白质二硫化物异构酶。免疫共沉淀法分析结果显示，肿瘤细胞中有ENO1、HSP60、KRT8和TUBB的瓜氨酸化和表达。结论肿瘤细胞系中存在ENO1、HSP60、KRT8和TUBB被瓜氨酸化的现象。

关键词：肿瘤蛋白质瓜氨酸化二维蛋白质印迹法

瓜氨酸化波形蛋白对树突状细胞成熟及功能的影响

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现代免疫学 2012年第2期32卷 135-139页

作者：宗明张慧孙立山李牛虞珊珊范列英同济大学附属东方医院检验科上海200120

为研究瓜氨酸化波形蛋白(citrullinated vimentin,cVim)对外周血单个核细胞来源树突状细胞(dendritic cells,DC)的成熟和功能的影响,本文通过分离外周血单个核细胞,GM-CSF和IL-4体外培养制备未成熟DC(immature DC,imDC),分别用脂多糖(L... 详细信息

为研究瓜氨酸化波形蛋白(citrullinated vimentin,cVim)对外周血单个核细胞来源树突状细胞(dendritic cells,DC)的成熟和功能的影响,本文通过分离外周血单个核细胞,GM-CSF和IL-4体外培养制备未成熟DC(immature DC,imDC),分别用脂多糖(LPS)、波形蛋白(vimentin,Vim)和cVim刺激培养的imDC,流式细胞仪检测DC表面标志CD14、CD80、CD83、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ表达变化,ELISA方法检测培养上清液IL-6、IL-10、IL-12、IL-23、和IFN-γ含量。LPS显著诱导DC表面MHCⅡ、CD83、CD80和CD86表达上调(P值均瓜氨酸化修饰后有促进外周血单个核细胞来源imDC成熟、分泌炎症性细胞因子的作用。

关键词：波形蛋白树突状细胞瓜氨酸化

瓜氨酸化蛋白检测技术及其在类风湿关节炎检测中的应用

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中华风湿病学杂志 2017年第1期21卷 56-59页

作者：王菲张宇王海永管晓龙赵琴飞李晓军南京大学附属金陵医院(南京军区南京总医院)解放军临床检验医学研究所中心实验科 210002

蛋白质瓜氨酸化现象（citrullination）是一种翻译后修饰过程，是精氨酸向瓜氨酸的转化，这个转变可以导致相对分子质量增加984以及一个正电荷的丢失，从而改变蛋白质的结构和功能。在RA患者关节炎症部位，蛋白质的瓜氨酸化可诱导抗瓜... 详细信息

蛋白质瓜氨酸化现象（citrullination）是一种翻译后修饰过程，是精氨酸向瓜氨酸的转化，这个转变可以导致相对分子质量增加984以及一个正电荷的丢失，从而改变蛋白质的结构和功能。在RA患者关节炎症部位，蛋白质的瓜氨酸化可诱导抗瓜氨酸化蛋白抗体（anti-citmllinated protein antibodies，ACPAs）的产生。ACPAs是RA重要的生物标志物，在疾病早期就可以在患者血清及关节液中检测到，已被作为一种重要的RA诊断和预测标志物。研究证实，

关键词：瓜氨酸化检测技术蛋白质类风湿关节炎 protein 生物标志物 RA患者应用

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瓜氨酸化现象对类风湿关节炎研究的启示

中华风湿病学杂志 2013年第10期17卷 649-651页

作者：常晓天山东省千佛山医院医学研究中心济南250014

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的自身免疫病，该病在我国发病率约为0．3％～0．5％。RA的组织病理特征为关节侵蚀性滑膜炎、滑膜增生、血管翳形成，以及由此造成的关节软骨和骨质破坏，最终... 详细信息

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的自身免疫病，该病在我国发病率约为0．3％～0．5％。RA的组织病理特征为关节侵蚀性滑膜炎、滑膜增生、血管翳形成，以及由此造成的关节软骨和骨质破坏，最终导致关节畸形及致残。

关键词：类风湿关节炎瓜氨酸化组织病理特征自身免疫病性关节炎滑膜增生骨质破坏关节软骨