瑞德西韦抑制胶质母细胞瘤细胞增殖和迁移侵袭的作用及机制研究

作     者：任洁 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王毅

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：RDS GBM 细胞增殖 迁移侵袭 FAK/PI3K/AKT信号通路 

摘      要：胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是中枢神经系统实体瘤中常见的神经上皮肿瘤,被世界卫生组织(WHO)归类为Ⅳ级胶质瘤,是恶性程度最高、致命性最强的原发性脑肿瘤。除此之外,GBM是脑瘤中最具侵袭性的一种,其侵袭性特征部分是由于其高迁移潜能从而侵入周围组织。GBM患者的预后极差,一般确诊后的中位生存期仅为14个月,1年生存率为39.5%,5年生存率仅为5.4%。GBM的全球年发病率约为3～4/10万人,在发展中国家十分常见。临床上GBM的常规治疗手段是手术切除后辅以放疗和替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)治疗,但TMZ易出现耐药性问题,大部分患者在接受治疗后6个月内易复发。因此,亟需探索新的GBM治疗药物。药物再利用(也称为老药新用)是将已批准药物用于另一适应症,具有降低药物研发失败风险、缩短研发周期、降低研发成本等优势。我们前期药物筛选发现瑞德西韦(Remdesivir,RDS)具有较强的抗GBM细胞的活性。RDS是一种新型的1’-氰基取代核苷类似物的磷酸化前药,是一种广谱抗病毒药物,对多种RNA逆转录病毒有较好的抑制作用,包括埃博拉病毒、冠状病毒等。RDS通过抑制RNA逆转录病毒中的RNA依赖型RNA聚合酶(Rd Rp)发挥抗病毒作用,其三磷酸代谢物NTP可作为RNA合成底物掺入病毒RNA中,与内源性核苷酸竞争,导致复制提前终止,以此抑制病毒增殖。血液和大脑之间形成的可渗透血脑屏障是影响GBM药物治疗效果的一大原因,而RDS具有良好的血脑屏障渗透能力。近年来,大量证据表明一些抗病毒药物具有抗肿瘤活性,而且也发现抗病毒药物与常用化疗药物联用可增强抗肿瘤效果。然而,RDS对GBM细胞的影响以及分子作用机制尚不清楚,缺乏相关研究。在本文中,我们通过开展体外细胞学和体内动物实验研究RDS在抑制GBM细胞增殖和迁移侵袭中的作用,并探索其分子作用机制。本文所取得的主要研究结果如下:1、RDS抑制GBM细胞的增殖和克隆形成能力为了探究RDS对GBM细胞增殖的影响,我们使用不同浓度的RDS处理5种GBM细胞系,发现随着药物浓度升高,细胞活力逐渐降低,且呈现出明显的浓度依赖效应。RDS对U87-MG和LN229 GBM细胞的抑制效果最为显著,其半抑制浓度(IC50值)分别为11.88μM和5.418μM。我们通过MTT实验、细胞计数实验、Edu实验及平板克隆形成实验检测发现RDS能显著抑制GBM细胞增殖和克隆形成能力。通过流式细胞术检测RDS对GBM细胞周期进程的影响,发现RDS能够使细胞阻滞在G2/M期。免疫印迹实验检测相关周期蛋白表达发现G2/M期相关蛋白cyclin B1、cyclin A2和CDK1显著下调。通过软琼脂克隆形成实验和皮下成瘤实验发现RDS显著抑制GBM细胞在体外体内实验条件下的成瘤能力。2、RDS抑制GBM细胞的迁移和侵袭能力为了探究RDS对GBM细胞迁移和侵袭能力的影响,我们通过细胞划痕愈合实验和细胞迁移能力分析实验发现RDS能够显著抑制GBM细胞迁移能力。通过在加基质胶的小室中进行细胞侵袭能力分析实验发现RDS能够显著抑制GBM细胞侵袭能力。最后通过免疫印迹实验检测RDS对迁移侵袭相关蛋白的影响,结果显示N-cadherin和Vimentin表达下调,而E-cadherin表达上调。3、RDS抑制GBM细胞的FAK/PI3K/AKT信号通路为了探究RDS抑制GBM细胞增殖和迁移侵袭能力的作用机制,首先对RDS处理后的GBM细胞进行RNA转录组测序分析,测序结果显示调控肿瘤细胞迁移侵袭的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)、细胞外基质受体相互作用(ECM receptor interaction)、上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关基因发生了显著下调;此外,正向调控肿瘤细胞增殖和迁移侵袭的FAK/PI3K/AKT信号通路也明显被抑制。通过免疫印迹实验验证RDS处理后FAK/PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达,发现FAK、PI3K、AKT蛋白磷酸化水平明显下降,证实此信号通路被RDS所抑制。4、RDS通过抑制FAK/PI3K/AKT信号通路抑制GBM细胞的增殖和迁移侵袭为了进一步研究RDS抑制GBM细胞增殖和迁移侵袭的作用与FAK/PI3K/AKT信号通路的关系,我们通过检测FAK抑制剂PF573228或PI3K抑制剂LY294002与RDS联用后对GBM细胞增殖和迁移侵袭能力的影响,结果发现GBM细胞增殖和迁移侵袭能力被进一步抑制,并通过免疫印迹实验检测FAK/PI3K/AKT信号通路相关蛋白得到验证。这些结果说明RDS可通过调控FAK/PI3K/AKT信号通路而发挥抑制GBM细胞增殖和迁移侵袭的作用。综