基于质谱的微量细胞蛋白质组学新方法研究

作     者：赵洪仙 

作者单位：军事科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：秦伟捷

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 

主      题：蛋白质组学 样本前处理 质谱 微孔芯片 微量蛋白质组 

摘      要：蛋白质是生命活动的核心,在维持机体正常代谢和物质运输中发挥着至关重要的作用。随着质谱的快速发展,质谱技术已经成为了研究蛋白质组学的重要手段。基于质谱的蛋白质组学方法已经能够定量复杂样本中的数千至上万种蛋白质,这为我们深入了解蛋白质的功能和作用提供了重要的技术工具。蛋白质在进入质谱进行鉴定分析之前,需要先进行一系列的样品前处理,这一过程导致了大量样品损失。为了实现深度覆盖,常量蛋白质组学分析往往至少需要大于1μg的样本起始量。然而对生殖细胞和循环肿瘤细胞等稀有细胞进行研究时,难以获得足够多的样本量。从灵敏度的角度来看,微量-单细胞蛋白质组学的检测极具挑战性。因此迫切需要开发高效的样品处理方法,减少蛋白质/多肽的损失,以达到深入分析稀有样本蛋白质组的目的。针对微量细胞研究,已经开发了很多前处理方法,目前应用较多的方法是控制反应体系最小化。这种策略通常需要专门的设备或训练有素的人员来操作,对普通实验室提出了较高要求,因此限制了它们的广泛应用。基于此,我们开发了一种可与流式细胞分选仪相衔接的角型尖端枪头装置,用于微量细胞(1000个细胞)的快速样品制备。角型尖端枪头为从细胞捕获、裂解到蛋白质消化的整个蛋白质组学样品处理工作流程提供了一个“反应容器,消除了由于样品转移而引起的蛋白质损失。角型尖端枪头表面提前进行抗吸附处理,进一步减少了由于非特异性吸附引起的样品损失。利用这一策略,在4.5小时内,从10～1000个H e La细胞中鉴定出1241±38～4110±37种蛋白质和4010±700～34879±575条肽段。该方法能够与流式细胞分选仪兼容,通量较高。在鉴定结果方面也优于已报道的方法和商业试剂盒,且具有很高的定量重现性。操作简单快捷,有利于在普通实验室中进行推广使用。虽然角型尖端枪头成功用于微量细胞样品的前处理,但该策略在微量细胞层面仍存在反应体积较大,样品损失明显的局限。基于此,我们制备了微孔容积只有600 n L的微孔芯片作为反应容器,搭建了可以衔接流式细胞分选仪的微孔芯片微量细胞样本前处理平台。该平台不仅具有流式细胞分选仪精度高、通量大的特点,能够快速且精准地分选不同亚型、不同数量的细胞,还具有微孔芯片表面积小、非特异性吸附少、反应体积小、酶解效率高等优势,为微量细胞的规模化鉴定分析提供有力支撑。利用基于流式细胞分选-微孔芯片的样本前处理平台,从1～100个He La细胞中鉴定出987±10～3120±17种蛋白质和5540±114～20738±428条肽段。我们将这一策略应用到100个经不同培养方式获得的小鼠肝实质细胞中,可以鉴定到约2500种蛋白和15000条肽段。进一步对这些蛋白质组进行分析,探索了不同培养方式下小鼠的肝实质细胞蛋白质组的变化,对流式细胞分选-微孔芯片微量细胞样本前处理平台的应用提供的新的可能。