齐整小核菌硬葡聚糖生物合成关键基因GME4934与GME1658功能分析
作者单位：西南大学
学位级别：硕士
导师姓名：罗锋;常鹏
授予年度：2022年
学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学]
摘 要：在全球化石能源匮乏的情形下,微生物胞外多糖(EPS)因其具有优良理化性质和可再生性等优点而被作为不可再生能源的替代品被广泛应用,其需求量和年产值持续快速增长。近年来,硬葡聚糖(scleroglucan,β-(1,3)-(1,6)-glucan)作为多用途的EPS而被广泛研究。硬葡聚糖是一种非离子线性多糖,具有独特的三重螺旋结构,具有良好的假塑性、水溶性、生物可降解性、耐高温性、耐盐性、粘度稳定性等特性,还具有抗菌、抗肿瘤和抗病毒活性,被广泛应用于石油、化工、食品、医药等行业,其全球市场正在不断上升。但硬葡聚糖的生产过程存在产量低、能耗高、排放大量废水废渣等问题,实现绿色生产硬葡聚糖迫在眉睫。本研究以微生物代谢工程为技术手段,以实现绿色高效生产硬葡聚糖为目标,开展研究工作。硬葡聚糖生物合成途径的分子机制研究甚少,仅通过转录组学预测了其生物合成途径与相关基因而未实验证实,通过代谢工程菌种改良提高硬葡聚糖产量等研究更未涉及。其中瓶颈在于硬葡聚糖工业生产的主要菌株主要为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii),缺乏高质量的基因组数据和有效的遗传转化方法与基因编辑工具系统。本课题组前期工作发现齐整小核菌GME4934基因和GME1658基因表达水平与硬葡聚糖的产量紧密正相关的现象。基于此,本研究对这两个基因的功能进行了探究分析,同时开展了代谢工程菌构建相关的初步工作。主要工作和结果如下:(1)GME4934与GM1658蛋白催化功能鉴定。在大肠杆菌表达系统中,大量表达融合蛋白GME4934-6x His与GME1658-6x His,采用镍柱法对其进行纯化,将纯化产物进行体外催化合成反应后。通过实验发现,本实验所构建的表达菌株p Sr V36(GME4934-6x His)和p Sr V37(GME1658-6x His)目标蛋白能够正确表达,但是表达量很低,蛋白浓度低。将纯化得到的GME4934-6x His进行蛋白催化活性检测,未检测到预期的β-(1,3)-glucan聚合酶的活性。这与GME4934保守结构域预测显示其仅含有一个SMI1＿KNR4结构域一致,猜测GME4934可能参与硬葡聚糖生物合成第四步β-(1,3)-glucan合酶的活性调节。而GME1658-6x His蛋白表达非常困难,可能与其编码序列长达3 kb且含有信号肽有关。(2)GME1658在酿酒酵母中的结构域功能互补验证。在酵母菌株中,负责细胞壁多糖合成的Sc Gas1p和Sc Bgl2p已经被证实分别具有β-(1,3)-glucan合酶功能和β-(1,3)-(1,6)-glucan合酶功能,催化功能结构域分别为Glyco＿hydro＿72和Glyco＿hydro＿17。GME1658结构域预测显示其含有同类的Glyco＿hydro＿31结构域。为证实GME1658的结构域是否具有相似活性,本实验通过将GME1658的Glyco＿hydro＿31回补到gas1Δ和bgl2Δ突变菌株,检测菌株在含有刚果红的培养基上生长表型,进而验证该结构域是否具有相应活性。初步实验表明GME1658的Glyco＿hydro＿31结构域未能回补gas1Δ和bgl2Δ突变菌株的生长缺陷。无法判断GME1658的Glyco＿hydro＿31结构域是否具有催化功能活性。(3)硬葡聚糖代谢工程基础体系的初步构建。本研究首次建立了齐整小核菌电穿孔转化法,并进行了电击参数优化。成功将外源DNA转入野生型齐整小核菌中,转化子在含有抑制浓度杀真菌剂的液体培养和固体培养基中都能够生长。外源片段中的Ds Red红色荧光蛋白在齐整小核菌中可以有效表达,转化子阳性率在50%左右。在场强为2 k V/cm,电击时间为1 ms,DNA/感受态细胞比例为1μg/100 mg湿重,电击次数为1次时,转化效率最高。构建了启动子、终止子、抗性基因、功能基因元件,并对其进行了接口的驯化。利用电击转化法验证抗性基因的可用性。研究测试了五种常用的杀菌剂对齐整小核菌的有效性并确定其有效抑制浓度。然后将含有五种抗性基因表达盒通过电穿孔转化法转入齐整小核菌,实验得到Carboxin、Basta、G418三种抗性基因的转化子,并且三种抗性基因的转化子均检测到红色荧光蛋白的表达,其中Carboxin抗性基因转化子的遗传稳定性最好,能够稳定遗传至第四代。而潮霉素B和中生菌素抗性基因未得到转化子。综合结果表明Carboxin、Basta、G418三种抗性基因可直接用于齐整小核菌。在此基础上,本研究利用Golden Gate DNA组装系统,将基因元件连接,构建了一系列p GT类的转录单元质粒,并对其进行了酶切位点和接口的驯化。然后基于Golden Gate DNA组装系统将转录单元质粒连接构建成含有不同抗性基因和GME493
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