非洲猪瘟病毒p54和pI215L蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

作     者：卢婷 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姜平

授予年度：2021年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：非洲猪瘟病毒 p54 pI215L 原核表达 ELISA 

摘      要：非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种病毒性传染病,可感染各年龄段及各种类的猪,并以发热、呼吸障碍、全身出血为显著临床特征,是唯一的虫媒DNA病毒,该疫病暴发后猪只病死率达100%,给生猪产业及当地经济带来巨大冲击。ASFV E183L基因长约555bp,编码的p54蛋白是该病毒的主要结构蛋白之一,抗原性较强,能诱导产生中和抗体,参与病毒入侵宿主细胞的过程及病毒内囊膜的转化,诱导细胞凋亡。ASFV I215L基因长约639bp,编码p I215L蛋白,与E2泛素偶联酶有相似功能,对病毒DNA复制和基因组转录有关键性作用。本研究表达并纯化了p54和p I215L蛋白,制备特异性多克隆抗体,并以纯化的重组蛋白作为包被抗原建立了ASFV间接ELISA抗体检测方法,具体内容如下:1.ASFV p54和p I215L蛋白原核表达与鉴定采用PCR方法扩增ASFV E183L和I215L基因,分别克隆至大肠杆菌表达质粒p ET-28a(+),构建了2个重组质粒p ET-28a-p54和p ET-28a-I215L。将重组质粒分别转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导表达,证明p54和p I215L蛋白呈可溶性表达。将重组大肠杆菌诱导表达后超声裂解菌液,离心后取上清用亲和层析方法纯化获得纯净的蛋白,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,证明目的蛋白具有良好抗原性。以纯化的重组蛋白制备鼠源多克隆抗体,ELISA和IFA试验结果证明抗p54和抗p I215L血清具有良好特异性,为该蛋白生物学功能研究和ELISA抗体检测方法建立提供了材料支持。2.ASFV p54和p I215L蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立用上述纯化的p54和p I215L重组蛋白作为包被抗原,建立了p54和p I215L间接ELISA抗体检测方法,其优化的反应条件为:抗原的最佳包被浓度为2.0μg/m L,包被时间为37℃包被两小时后4℃过夜,封闭液为0.5%BSA溶液,封闭时间为37℃孵育3h,待检血清的最佳稀释度为1:100、血清最佳作用时间为37℃孵育30min(p54)和1h(p I215L),酶标SPA最佳稀释倍数为1:5000、最佳作用时间为15min,TMB最佳作用时间为37℃避光显色10min(p54)和5min(p I215L),终止显色后根据酶标仪读数的OD值计算P/N最大值作为判定标准。p54-ELISA检测方法临界值判定方法为:当待检样品的S/P值≥0.227判定阳性,S/P0.172时判定阴性,介于0.172和0.227之间判定为可疑,其敏感性为95%,批内批间重复性变异系数为0.66%～7.34%。p I215L-ELISA检测方法临界值判定方法为:当待检样品的S/P值≥0.208时判定阳性,S/P0.159时判定阴性,介于0.159和0.208之间判定为可疑,其敏感性为100%,批内批间重复性变异系数为1.31%～6.57%。两种方法与猪圆环病毒2型、猪塞内卡病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒和经典猪瘟病毒阳性血清均无交叉反应。采用两种方法与法国IDvet ASFV抗体检测试剂盒同时检测127份猪临床血清样品,p54-ELISA、p I215L-ELISA与商品化试剂盒符合率分别为91.3%和88.2%,证明p54-ELISA方法优于p I215L-ELISA方法,该方法可用于ASFV血清抗体的检测。