线粒体蛋白MiNT性质及转移[2Fe-2S]簇的研究

作     者：郝晓媛 

作者单位：山西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵亚琴

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071009[理学-细胞生物学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：MiNT蛋白 蛋白构象 氧化还原 [2Fe-2S]簇 

摘      要：铁硫簇作为蛋白质的辅因子参与了多种重要的生理过程,如有氧呼吸、DNA复制和修复以及辅因子生物合成。细胞将铁、硫组装成铁硫簇后转移至受体蛋白从而实现生物功能。NEET蛋白是以铁硫簇为辅因子的蛋白质,其氨基酸序列包含CDGSH基序。人细胞中有三种NEET蛋白:含有一个CDGSH基序的蛋白---mNT(mitoNEET)和NAF-1(Nutrient-deprivation autophagy factor-1)和包含两个CDGSH基序的蛋白MiNT。本论文研究了MiNT蛋白的基本性质和MiNT蛋白[2Fe-2S]簇的氧化还原性质,最后初步探索了MiNT蛋白将[2Fe-2S]簇转移至受体蛋白。首先,通过荧光光谱法研究了MiNT-H75C蛋白与盐酸吡格列酮(PIO)的相互作用,其结合比为1:1,结合常数为1.31×10 M;盐酸吡格列酮与MiNT-H75C蛋白结合的荧光强度主要源于色氨酸;MiNT-H75C蛋白的Trp和PIO距离r为2.03 nm。盐酸吡格列酮(PIO)占据MiNT-H75C蛋白的疏水空腔,蛋白的疏水性结构域外露程度明显降低;盐酸吡格列酮对MiNT-H75C蛋白的[2Fe-2S]簇有稳定作用。其次,利用不同还原剂连二亚硫酸钠(Dith)、二硫苏糖醇(DTT)还原MiNT蛋白中的[2Fe-2S]簇,发现连二亚硫酸钠(Dith)可以使得铁硫簇中铁完全还原,而二硫苏糖醇(DTT)可以使其部分还原,该过程是可逆的。盐酸吡格列酮对过氧化氢氧化的MiNT蛋白[2Fe-2S]簇没有影响;但是盐酸吡格列酮可能通过阻断巯基介导的蛋白中[2Fe-2S]簇的还原来调节MiNT蛋白的功能。MiNT蛋白His75、His113突变为Cys后蛋白的疏水环境改变,疏水结构外露程度减少。最后,通过定点突变方法,制备得到单铁硫簇蛋白MiNT-C60M-C62M;表达纯化得到了铁硫簇受体蛋白---FDX1蛋白,利用三氯乙酸酸化得到脱铁硫簇辅基蛋白:apo-FDX1蛋白。通过紫外-可见吸收光谱研究铁硫簇从MiNT蛋白和MiNT-C60M-C62M蛋白到apo-FDX1蛋白的转移,MiNT-C60M-C62M蛋白转移铁硫簇到受体蛋白的速率更快。厌氧条件下,DTT存在时,apo-MiNT可以将Fe和S体外组装铁硫簇并结合到蛋白的簇结合结构域,重组后的MiNT蛋白铁硫簇特征吸收峰为420 nm,证明其铁硫簇中铁为还原态。