转录因子CTCF转录调控SFPQ促进骨肉瘤恶性生物学行为的机制研究

作     者：仲新宇 

作者单位：江苏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李大鹏

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：骨肉瘤 CTCF SFPQ 转录因子 

摘      要：背景:骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是骨组织中最为常见的恶性肿瘤,好发于青少年,关于其发病机制的研究一直在探索中。研究发现,富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪接因子(Splicing factor proline and glutamine rich,SFPQ)是骨肉瘤发病的潜在致癌因子,但其对骨肉瘤具体的调控机制尚不清晰。CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)是编码多功能转录因子的候选肿瘤调控基因,其在骨肉瘤的作用及相关机制仍不清楚。本研究欲寻找SFPQ上游潜在的转录因子,探索二者在骨肉瘤增殖、迁移及侵袭中的作用,为骨肉瘤的临床治疗提供新的分子靶标。目的:本文旨在阐明CTCF在骨肉瘤中对SFPQ的转录调控作用,以及CTCF调控SFPQ的表达对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法:(1)使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、生存曲线及Depmap数据库分析确认SFPQ在骨肉瘤中的致癌作用;使用转录因子在线分析网站(PROMO、Animal TFDB3.0、JASPAR)及UCSC数据库筛选SFPQ的潜在转录因子为CTCF,并使用转录因子靶基因网站(hTFtarget)及GEPIA2数据库反向验证二者之间的相关性。然后使用qRT-PCR及免疫印迹实验(Western Blotting,WB)检测CTCF在骨肉瘤细胞系中的表达水平。(2)通过转染si-RNA或过表达质粒调控骨肉瘤细胞系中CTCF的表达水平。使用细胞平板克隆实验、EdU实验,CCK-8实验,细胞划痕实验及Transwell迁移、侵袭实验,检测不同表达水平的CTCF对骨肉瘤细胞增殖能力、迁移能力及侵袭能力的影响。(3)通过双荧光素酶报告实验验证CTCF与SFPQ之间的靶向关系。(4)通过在骨肉瘤细胞中共同转染CTCF过表达质粒与si-SFPQ进行拯救实验,检测CTCF与SFPQ在骨肉瘤细胞系中的调控作用关系,及其对骨肉瘤细胞生物学行为的共同影响。结果:(1)qRT-PCR、生存曲线及Depmap数据库分析确认SFPQ为骨肉瘤中致癌基因;UCSC及GEPIA2数据库筛选确认CTCF为SFPQ的潜在转录因子,且二者存在中度相关性;qRT-PCR及WB实验结果显示CTCF在骨肉瘤细胞系中呈高表达水平。(2)细胞功能实验结果显示,在骨肉瘤细胞系中敲低CTCF后,骨肉瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力被抑制;而在骨肉瘤细胞系中过表达CTCF后,骨肉瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力被增强。(3)双荧光素酶报告实验结果显示,相较于NC,在报告基因质粒载体组转染过表达CTCF后双荧光素酶活性得到增强。CTCF能够与SFPQ的启动子序列结合,并增强其表达水平。(4)拯救实验显示,过表达CTCF能够降低敲低SFPQ对骨肉瘤细胞系增殖、迁移、侵袭能力的抑制。结论:CTCF在骨肉瘤中发挥致癌作用,CTCF作为SFPQ的转录激活因子,正向调控促进SFPQ的表达,增强骨肉瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力,这表明靶向CTCF/SFPQ可以为进一步探索骨肉瘤的临床治疗提供研究策略。