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sfpq复合物及GAD1促进肠道病毒复制的机制研究

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SFPQ复合物及GAD1促进肠道病毒复制的机制研究

作者：王贯莹北京协和医学院

学位级别：硕士

肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属,基因组为单股正链RNA,是无包膜病毒,主要经由呼吸道传播。肠道病毒可以损害身体的不同系统并造成各种疾病,主要包括腹泻、呼吸道传染病、疱疹性咽峡炎、手足口病、急性迟缓性麻痹、心肌炎、脑炎、脑... 详细信息

肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属,基因组为单股正链RNA,是无包膜病毒,主要经由呼吸道传播。肠道病毒可以损害身体的不同系统并造成各种疾病,主要包括腹泻、呼吸道传染病、疱疹性咽峡炎、手足口病、急性迟缓性麻痹、心肌炎、脑炎、脑膜炎、胰腺炎等。由于肠道病毒使用的RNA依赖性RNA聚合酶无法进行校准,因此该病毒容易发生变异和重组。这使得肠道病毒的暴发流行对全球公共卫生安全构成了巨大挑战。目前预防肠道病毒感染的疫苗仅有脊髓灰质炎疫苗和EV-A71疫苗,尚没有特效的药物用于治疗肠道病毒感染。在病毒的生命周期中,病毒利用宿主蛋白促进自身复制,同时宿主蛋白又可抑制病毒的复制。因此从分子水平探究肠道病毒与宿主蛋白之间的相互作用机制,有助于寻找抑制肠道病毒的靶点,为肠道病毒的防控提供理论支持。本研究通过对EV-A71、EV-D68切割谱进行筛选,从中选取关键宿主蛋白人聚嘧啶结合剪接因子(sfpq/PSF)富含脯氨酸谷氨酰胺残基和非POU结构域八聚体结合蛋白(NONO/p54nrb),探究sfpq/NONO复合物促进肠道病毒复制的作用机制。首先,使用SiRNA敲低sfpq/NONO的表达,发现EV-A71病毒基因组的复制、蛋白的翻译及病毒滴度均受到了抑制,说明了 sfpq/NONO有助于EV-A71的复制。随后,通过免疫荧光共定位发现,EV-A71诱导sfpq/NONO发生出核现象,并在细胞质形成聚集性颗粒。通过病毒复制动力学结合免疫荧光共定位发现,sfpq/NONO感染EV-A71 2h能够观察到出核,而4h几乎均位于胞质中,且sfpq和NONO共同存在该聚集性颗粒中。通过RNA pull down发现sfpq/NONO与EV-A71的5'UTR的存在相互作用,且sfpq可以促进EV-A71 5'UTR介导的翻译。这些结果说明,肠道病毒的翻译依赖于感染后诱导出核的sfpq/NONO复合物。最后,通过外源转染EV-A71的3Cpro,发现3C对sfpq存在切割,并且3C的切割条带与病毒感染导致的切割条带一致,而当sfpq的113位和/或257位氨基酸突变后,切割条带消失。将sfpq野生型、切割片段与EV-A71 5'UTR-Luc共转发现,sfpq 114-707片段的促进EV-A71的翻译作用更强。以上结果说明了肠道病毒对sfpq的切割可以增强其辅助病毒翻译的作用。在促进病毒复制水平的宿主因子中,我们还发现谷氨酸脱羧酶1(GAD1)可以促进EV-A71、EV-D68、CV-A16和HRV16的复制。在HEK293T细胞中,过表达GAD1后,EV-D68的复制水平随GAD1转染量的增加而增强。将GAD1功能位点(405位赖氨酸)突变后,GAD1促进EV-D68复制的作用消失。使用GAD1的抑制剂3-巯基丙酸(3-MPA)处理可以减弱GAD1促进EV-D68复制的作用。这说明GAD1促进EV-D68复制的作用是酶活性依赖的。GAD1的产物GABA也可以促进EV-D68的复制,说明了 GAD1是通过其产物GABA对EV-D68的复制起作用。综上所述,本研究发现EV-A71感染诱导核内分子sfpq/NONO出核形成聚集性颗粒,与EV-A71 5'UTR相互作用促进病毒RNA的翻译;EV-A71通过3Cpro对复合物中sfpq进行了切割,切割产物增强EV-A71 5'UTR介导的翻译作用。并且神经系统高表达分子GAD1在体外具有促进肠道病毒复制的作用。本研究的结果有助于深入理解肠道病毒的致病机理,也为抗病毒药物研究提供靶点。

关键词：肠道病毒 sfpq NONO 3Cpro GAD1

sfpq蛋白对骨骼肌成肌细胞分化及融合的影响

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SFPQ蛋白对骨骼肌成肌细胞分化及融合的影响

作者：曾淑俊吉林大学

学位级别：硕士

背景:骨骼肌占人体体重的40%,在运动和能量代谢中发挥着重要作用,是人体最重要的组织之一。骨骼肌由大量的肌纤维构成,每个多核肌纤维则是通过单核成肌细胞分化及融合而成。骨骼肌损伤后的修复也是通过肌卫星细胞(一种肌肉干细胞)激活... 详细信息

背景:骨骼肌占人体体重的40%,在运动和能量代谢中发挥着重要作用,是人体最重要的组织之一。骨骼肌由大量的肌纤维构成,每个多核肌纤维则是通过单核成肌细胞分化及融合而成。骨骼肌损伤后的修复也是通过肌卫星细胞(一种肌肉干细胞)激活、增殖、分化并相互融合形成新生肌纤维来完成的。骨骼肌的发育与损伤后修复对于生命活动的维持具有重要意义,成肌细胞融合是此过程中的重要环节。研究成肌细胞融合的机制对骨骼肌的正常发育以及损伤后修复至关重要。而成肌细胞分化融合是一个复杂的动态过程,受到许多细胞分子和蛋白的调控,但其机制尚不完全清楚。人脯氨酸/谷氨酰胺富含性剪接因子(Splicing factor proline and glutamine rich,sfpq)是一种DNA/RNA结合蛋白,参与m RNA的剪接、成熟和翻译。研究发现在成肌细胞中sfpq与DUX4(面肩肱型肌营养不良症的致病基因)共定位,过表达DUX4还引起sfpq的异位表达;而sfpq在成肌细胞分化融合过程中m RNA表达水平降低,且在成肌细胞融合前sfpq在细胞膜上表达,融合后消失,其去向尚不清楚。另有研究发现在骨骼肌中敲除sfpq会导致小鼠出现进行性肌肉质量减少和代谢性肌病,具体表现为骨骼肌质量降低、运动功能受损、严重的生长缺陷并出现过早死亡,表明sfpq参与骨骼肌发育过程。但此研究仅在快肌纤维中敲除了sfpq,且并未探究敲除sfpq对成肌细胞分化融合的影响,sfpq在该过程中的作用尚不明确。目的:1.探究sfpq在成肌细胞分化融合过程中的作用。2.观察sfpq在成肌细胞分化融合过程中的定位变化。方法:***-q PCR和Western blot检测sfpq在成肌细胞分化融合和骨骼肌发育、损伤修复(心脏毒素肌内注射)过程中m RNA和蛋白表达变化。2.利用免疫荧光或CRISPR/Cas9技术在成肌细胞sfpq的N端插入GFP,观察sfpq在成肌细胞分化融合过程中的定位变化。3.利用CRISPR/Cas9技术在成肌细胞中敲除sfpq,观察其对分化融合的影响。结果:1.在体外成肌细胞分化融合过程中sfpq m RNA表达量降低,蛋白表达量先升高后降低;在出生后小鼠骨骼肌发育和损伤修复过程中m RNA和蛋白都是先升高后降低。2.在成肌细胞分化融合前,sfpq蛋白在细胞膜、细胞浆和细胞核中都有表达,分化融合早期sfpq从膜和胞浆中转移到核中,分化融合晚期又从核中转移到胞浆中。3.在C2C12细胞中建立了CRISPR/Cas9基因编辑方法,目前已筛选出sfpq蛋白敲除效率75%的成肌细胞单克隆。结论:***蛋白在成肌细胞分化融合活跃期表达升高,参与成肌细胞分化融合过程。***蛋白在成肌细胞分化融合过程中发生了定位变化。

关键词：骨骼肌成肌细胞分化与融合 sfpq CRISPR/Cas9

海马过表达sfpq改善AD小鼠认知及记忆的机制研究

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海马过表达SFPQ改善AD小鼠认知及记忆的机制研究

作者：铁金杉昆明医科大学

学位级别：硕士

【目的】阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease)是一种影响颇大的神经退行性疾病,其发病因素众多且复杂,因此一直在探索但仍未有较好的治疗方法。课题组前期研究发现sfpq(Splicing factor proline and glutamine-rich)可能具有抗氧化的相... 详细信息

【目的】阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease)是一种影响颇大的神经退行性疾病,其发病因素众多且复杂,因此一直在探索但仍未有较好的治疗方法。课题组前期研究发现sfpq(Splicing factor proline and glutamine-rich)可能具有抗氧化的相关功能,于是本研究以sfpq(富含脯氨酸和谷氨酰胺剪接因子)为研究的主变量,探究其对Aβ诱导的AD模型小鼠行为学及病理学的影响,并进一步探索和解析深层机制,为治疗AD提供分子靶标,这也是首次在AD小鼠模型海马中直接过表达sfpq探究其作用机制。【方法】(1)利用Aβ侧脑室注射制作阿尔茨海默病小鼠模型,14天后利用新物体和Y迷宫、旷场实验验证造模成功。(2)将造模成功的小鼠分为两组:(1)空载体组(Vector);(2)过表达sfpq组(AAV-sfpq);分别在小鼠海马两侧注射Vector和AAV-sfpq,均为1ul。(3)病毒注射三周后,行为学检测小鼠认知和记忆情况,处死取材,取各组小鼠双侧海马组织。用免疫荧光证明海马过表达sfpq成功且过表达的sfpq主要定位于神经元;用Western Blot检测sfpq、抗氧化的相关蛋白GST、HO-1、AD相关标记蛋白APP、Tau、突触和记忆相关蛋白p-CREB、PSD95、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax以及信号通路相关p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白的表达水平;用HE染色观察注射病毒前后海马区域的组织病理改变;用尼氏染色观察尼氏小体情况。【结果】(1)经行为学新物体识别、Y迷宫、旷场实验验证,利用Aβ侧脑室注射成功建立了AD小鼠模型;(2)Western Blot、免疫荧光实验证实,利用腺相关病毒转染技术在AD小鼠海马CA1、CA2、CA3成功过表达sfpq;(3)过表达sfpq后,AD小鼠认知及记忆能力明显改善,变化有统计学意义;(4)过表达sfpq后,小鼠海马组织内AD相关病理蛋白APP、Tau明显下降,抗氧化酶GST、HO-1表达明显上调,抗凋亡相关蛋白Bcl-2与凋亡相关蛋白Bax比值明显上调,突触相关蛋白PSD95、记忆相关蛋白p-CREB表达明显上调,变化均有统计学意义;(5)过表达sfpq后,AD小鼠海马组织内磷酸化PI3K与总PI3K比值、磷酸化AKT与总AKT比值明显上调,变化有统计学意义。【结论】(1)海马过表达sfpq可明显改善AD小鼠的认知及记忆能力。(2)海马过表达sfpq可以上调抗氧化酶GST和HO-1、下调APP和Tau、增强神经元抗凋亡能力、上调p-CREB、PSD95蛋白、激活PI3K/AKT通路。sfpq可能是通过激活PI3K/AKT通路而上调抗氧化酶系统、下调AD相关病理蛋白、增强神经元抗凋亡能力、改善突触功能和长时程增强效应,从而改善AD小鼠的认知及记忆能力。(3)sfpq可能是AD防治的重要潜在分子靶点。

关键词： sfpq 阿尔茨海默病氧化应激 PI3K/AKT通路

uc. 12+A及其宿主基因sfpq在B细胞淋巴瘤中的功能及机制研究

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uc. 12+A及其宿主基因SFPQ在B细胞淋巴瘤中的功能及机制研究

作者：张欣扬州大学

学位级别：硕士

淋巴瘤是一种原发于淋巴结与淋巴组织的恶性肿瘤,其发病率在恶性肿瘤中高居第九位,约占所有恶性肿瘤的4%,从世界范围内来看,淋巴瘤的死亡率亦呈逐年上升趋势。B细胞淋巴瘤为B细胞来源的恶性肿瘤,本课题主要研究的是非霍奇金B细胞淋巴瘤... 详细信息

淋巴瘤是一种原发于淋巴结与淋巴组织的恶性肿瘤,其发病率在恶性肿瘤中高居第九位,约占所有恶性肿瘤的4%,从世界范围内来看,淋巴瘤的死亡率亦呈逐年上升趋势。B细胞淋巴瘤为B细胞来源的恶性肿瘤,本课题主要研究的是非霍奇金B细胞淋巴瘤。大部分B细胞淋巴瘤的发生发展与促癌基因的激活和/或抑癌基因的失活密切相关。促癌蛋白c-myc是参与细胞增殖、凋亡等的关键性转录因子,已有研究发现其在B细胞淋巴瘤中发挥关键作用。随着对B细胞淋巴瘤研究的不断深入,寻找新的治疗靶点,在基因水平上进行研究以改善B细胞淋巴瘤的临床预后则具有极其重要的意义。长链非编码RNA(longnoncoding RNA,lncRNA)是转录本序列长度大于200nt,且不具备蛋白质编码潜能的RNA。超保守区域(Ultraconserved Regions,UCRs)是在人、小鼠和大鼠基因中的一段极度保守的基因序列的非编码基因区域。由UCR所编码的特殊的长链非编码RNA超保守区域转录子(transcribed ultraconserved regions,T-UCRs)被定义为一类特殊的lncRNA,碱基长度为200-799 bp左右。超保守RNA uc.12+A的编码基因位于脯氨酸/谷氨酰胺富含性剪切因子(splicing factor proline and glutamine rich,sfpq)第9号和第10号外显子之间的内含子中。因此,sfpq可以看做是uc.12+A的宿主基因。sfpq是一种普遍存在且丰富的核RNA结合蛋白,属于DBHS蛋白家族,调节mRNA的转录及DNA损伤修复等。目前,关于uc.12+A是否存在生物学功能及其与sfpq之间是否具有调控作用尚无相关文献报道。课题组前期通过构建Myc激活组(Myc-on)小鼠和Myc失活组(Myc-off)小鼠的B细胞淋巴瘤模型,高通量芯片检测T-UCRs的表达差异,发现在Myc-on激活状态下,uc.12+A高表达。本研究检测uc.12+A在小鼠B细胞和小鼠B细胞淋巴瘤细胞株中的表达水平,并研究过表达uc.12+A后,在体内外对B淋巴瘤细胞株生物学行为的影响,并且初步探究uc.12+A过表达与其宿主基因sfpq的关系,继而为B细胞淋巴瘤的治疗和干预在基因水平上提供新的靶点和理论支持。方法1、设计链特异性引物和普通引物,qRT-PCR技术检测uc.12+A在小鼠B细胞和小鼠B细胞淋巴瘤细胞株中的表达水平。2、构建uc.12+A过表达逆转录病毒载体:从Pubmed和UCbase数据库查询uc.12+A的基因序列,PCR扩增该目的序列,Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ双酶切后连接到逆转录病毒表达载体pMSCV-PIG,通过测序,获得目的质粒。3、建立稳定过表达uc.12+A细胞系:将测序结果对比100%正确的目的质粒,通过Lipofectamine 6000TM转染到293T细胞中,收取病毒液,感染小鼠和人B淋巴瘤细胞株:38B9细胞和Romas细胞,polybrene增强感染效率,嘌呤霉素(puro)药筛使其感染率达90%以上,得到稳定过表达的uc.12+A-38B9细胞系和uc.12+A-Romas细胞系及其对照组细胞系。然后,qRT-PCR检测uc.12+A的表达水平,验证uc.12+A的过表达效果。4、功能实验:①细胞增殖:细胞计数实验检测uc.12+A过表达后在38B9细胞和Romas细胞中连续4天的增殖情况;②凋亡:取上述B淋巴瘤细胞株,加入AnnexinV和PI,室温避光孵育20 min,流式细胞术检测uc.12+A过表达后对其凋亡率的影响;③细胞周期:取上述B淋巴瘤细胞株,流式细胞术检测uc.12+A对其周期的影响;④荷瘤:每只小鼠(Balb/c和SCID)以1 × 106的细胞量进行小鼠皮下荷瘤,观察成瘤情况;⑤免疫组化:取实验组和对照组肿瘤,4%多聚甲醛固定48h,包埋制成蜡块,检测ki67的表达。5、qRT-PCR和Western Blot检测uc.12+A的宿主基因sfpq(脯氨酸/谷氨酰胺富含性剪接因子)在38B9-MSCV细胞和38B9-12+A细胞,Romas-MSCV细胞和Romas-12+A细胞的mRNA及蛋白水平。结果1、qRT-PCR结果显示,普通qRT-PCR和链特异性qRT-PCR两种检测方法中,与小鼠正常B细胞相比,uc.12+A在38B9细胞中表达上调。2、功能实验:①与对照组相比,过表达uc.12+A的细胞增殖速率显著升高;②过表达uc.12+A的38B9细胞和Romas细胞比对照组显示出更低的凋亡率;③uc.12+A能显著增加细胞周期中的S期,加速细胞生长;④体内实验中,过表达uc.12+A的实验组肿瘤比对照组肿瘤大得多;⑤与对照组相比,过表达uc.12+A的实验组ki67的表达水

关键词： B细胞淋巴瘤 c-myc 增殖凋亡 sfpq

转录因子CTCF转录调控sfpq促进骨肉瘤恶性生物学行为的机制研究

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转录因子CTCF转录调控SFPQ促进骨肉瘤恶性生物学行为的机制研究

作者：仲新宇江苏大学

学位级别：硕士

背景:骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是骨组织中最为常见的恶性肿瘤,好发于青少年,关于其发病机制的研究一直在探索中。研究发现,富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪接因子(Splicing factor proline and glutamine rich,sfpq)是骨肉瘤发病的潜在致癌因... 详细信息

背景:骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是骨组织中最为常见的恶性肿瘤,好发于青少年,关于其发病机制的研究一直在探索中。研究发现,富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪接因子(Splicing factor proline and glutamine rich,sfpq)是骨肉瘤发病的潜在致癌因子,但其对骨肉瘤具体的调控机制尚不清晰。CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)是编码多功能转录因子的候选肿瘤调控基因,其在骨肉瘤的作用及相关机制仍不清楚。本研究欲寻找sfpq上游潜在的转录因子,探索二者在骨肉瘤增殖、迁移及侵袭中的作用,为骨肉瘤的临床治疗提供新的分子靶标。目的:本文旨在阐明CTCF在骨肉瘤中对sfpq的转录调控作用,以及CTCF调控sfpq的表达对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法:(1)使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、生存曲线及Depmap数据库分析确认sfpq在骨肉瘤中的致癌作用;使用转录因子在线分析网站(PROMO、Animal TFDB3.0、JASPAR)及UCSC数据库筛选sfpq的潜在转录因子为CTCF,并使用转录因子靶基因网站(hTFtarget)及GEPIA2数据库反向验证二者之间的相关性。然后使用qRT-PCR及免疫印迹实验(Western Blotting,WB)检测CTCF在骨肉瘤细胞系中的表达水平。(2)通过转染si-RNA或过表达质粒调控骨肉瘤细胞系中CTCF的表达水平。使用细胞平板克隆实验、EdU实验,CCK-8实验,细胞划痕实验及Transwell迁移、侵袭实验,检测不同表达水平的CTCF对骨肉瘤细胞增殖能力、迁移能力及侵袭能力的影响。(3)通过双荧光素酶报告实验验证CTCF与sfpq之间的靶向关系。(4)通过在骨肉瘤细胞中共同转染CTCF过表达质粒与si-sfpq进行拯救实验,检测CTCF与sfpq在骨肉瘤细胞系中的调控作用关系,及其对骨肉瘤细胞生物学行为的共同影响。结果:(1)qRT-PCR、生存曲线及Depmap数据库分析确认sfpq为骨肉瘤中致癌基因;UCSC及GEPIA2数据库筛选确认CTCF为sfpq的潜在转录因子,且二者存在中度相关性;qRT-PCR及WB实验结果显示CTCF在骨肉瘤细胞系中呈高表达水平。(2)细胞功能实验结果显示,在骨肉瘤细胞系中敲低CTCF后,骨肉瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力被抑制;而在骨肉瘤细胞系中过表达CTCF后,骨肉瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力被增强。(3)双荧光素酶报告实验结果显示,相较于NC,在报告基因质粒载体组转染过表达CTCF后双荧光素酶活性得到增强。CTCF能够与sfpq的启动子序列结合,并增强其表达水平。(4)拯救实验显示,过表达CTCF能够降低敲低sfpq对骨肉瘤细胞系增殖、迁移、侵袭能力的抑制。结论:CTCF在骨肉瘤中发挥致癌作用,CTCF作为sfpq的转录激活因子,正向调控促进sfpq的表达,增强骨肉瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力,这表明靶向CTCF/sfpq可以为进一步探索骨肉瘤的临床治疗提供研究策略。

关键词：骨肉瘤 CTCF sfpq 转录因子

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sfpq的相关研究进展

昆明医科大学学报 2018年第10期39卷 134-138页

作者：孙欣李国萍陈绍春昆明医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系云南昆明650500 昆明医科大学第三附属医院头颈外科云南昆明650118 昆明医科大学国际教育学院云南昆明650500

sfpq(Splicing factor proline-and glutamine-rich)是一种DNA/RNA结合蛋白,参与RNA的剪接、成熟和翻译。近年来的研究发现,sfpq还与其他生命活动相关。就sfpq参与的DNA修复,肿瘤的发展,神经的发育与再生,甚至是神经退行性疾病的发生发... 详细信息

sfpq(Splicing factor proline-and glutamine-rich)是一种DNA/RNA结合蛋白,参与RNA的剪接、成熟和翻译。近年来的研究发现,sfpq还与其他生命活动相关。就sfpq参与的DNA修复,肿瘤的发展,神经的发育与再生,甚至是神经退行性疾病的发生发展相关研究作一阐述,不仅有助于对sfpq的认识,也为其相关研究提供一种新思路。

关键词： sfpq DNA修复神经发育神经退行性疾病肿瘤

uc.12+A及其宿主基因sfpq在小鼠B淋巴瘤细胞中的表达研究

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实用老年医学 2018年第8期32卷 713-716页

作者：朱明明华婧陈思源侯煜铖郭俊荣周芳超庞磊王继军张艳青扬州大学医学院江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室江苏省扬州市225001

目的利用链特异性逆转录聚合酶链式反应(strand-specific reverse transcriptase-polymerase chain reaction,strand-specific RT-PCR)方法,检测超保守RNA uc.12+A及其宿主基因sfpq在小鼠B淋巴瘤细胞(38B9、myc3)中的表达水平,并与普通RT-PCR方法相比较。方法根据uc.12+A的序列设计链特异性逆转录引物,以小鼠B淋巴瘤细胞的RNA为模板进行反转录获得c DNA。随后通过实时荧光定量PCR技术,检测uc.12+A在小鼠B淋巴瘤细胞中的表达水平,并与普通RT-PCR的表达结果进行对比。在同样的淋巴瘤细胞株中通过RT-PCR与western blot检测宿主基因sfpq的表达。结果在小鼠B淋巴瘤细胞株中,sfrand-specific RT-PCR检测到的uc.12+A表达较普通RT-PCR检测到的水平低,2种方法检测的uc.12+A在小鼠B淋巴瘤细胞中表达均显著高于小鼠正常B细胞中的水平。sfpq在B淋巴瘤细胞中的表达亦显著高于正常B细胞。结论 uc.12+A与宿主基因sfpq在小鼠B淋巴瘤细胞中的表达显著增高。

关键词：超保守RNA sfpq B淋巴瘤细胞链特异性RT-PCR

海马过表达Gαq改善衰老小鼠学习记忆能力的机制研究

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海马过表达Gαq改善衰老小鼠学习记忆能力的机制研究

作者：罗浩丹昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]Gαq是G蛋白α亚单位家族的重要成员,是体内一个重要的信号通路蛋白。课题组前期研究发现,人神经元样细胞株SY5Y和大鼠神经元样细胞株PC12中过表达Gαq明显增强了细胞的抗氧化损伤能力,机制可能与过表达的Gαq激活ERK、Nrf2通路... 详细信息

[目的]Gαq是G蛋白α亚单位家族的重要成员,是体内一个重要的信号通路蛋白。课题组前期研究发现,人神经元样细胞株SY5Y和大鼠神经元样细胞株PC12中过表达Gαq明显增强了细胞的抗氧化损伤能力,机制可能与过表达的Gαq激活ERK、Nrf2通路、抑制NF-κB通路有关。进一步研究发现,过表达Gαq的神经元样细胞中sfpq明显上调。sfpq是一种DNA/RNA结合蛋白,参与了多种神经退行性疾病的发生发展。鉴于上述结果均为体外研究所得,本课题拟检测不同年龄小鼠海马中Gaq和sfpq的表达水平,以明确Gaq、sfpq表达水平随年龄变化的相关性,并构建D-半乳糖致小鼠衰老模型,研究衰老小鼠海马过表达Gαq后学习记忆能力的变化及相关机制,从模型动物层面为Gaq作为抗神经衰老治疗靶点提供依据。[方法]（1）取年龄为1天、7天、14天、2个月、6个月、18个月的昆明小鼠各5只,麻醉后立即用4℃生理盐水心脏灌注,解剖分离出脑海马,用免疫印迹法（Western Blot,WB）实验检测Gαq与sfpq蛋白表达水平。（2）取2月龄雄性昆明小鼠40只,随机分成2组,每组20只,模型组（DG组）腹腔注射D-半乳糖构建小鼠衰老模型,对照组（NC组）腹腔注射等量生理盐水。（3）造模结束后用水迷宫实验（Morris water maze,MWM）进行检测,并将模型组随机分成2组,每组10只,治疗组（Gαq+DG组）双侧海马注射腺病毒过表达Gαq,安慰组（VECTOR+DG组）双侧海马注射含空载体的腺病毒,对照组也随机分为2组,Gαq+NC组和VECTOR+NC组,分别给予治疗组和安慰组同样的处理。（4）注射病毒4个星期后,用MWM水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力;MMW实验后立即处死小鼠,用化学比色法检测海马过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活力;用WB实验检测小鼠海马Gαq、sfpq、谷胱甘肽巯基转移酶（GST）、血红素加氧酶1（HO-1）、环磷腺苷反应元件结合蛋白（CREB）及其磷酸化形式p-CREB的表达水平;用免疫荧光技术检测Gαq、sfpq、BCL-2在小鼠海马的表达水平。[结果]（1）小鼠海马内Gαq、sfpq水平随着年龄增长而逐渐下降,二者表达水平随年龄的变化呈正相关关系。（2）小鼠连续4周腹腔注射D-半乳糖后,学习记忆能力明显下降,海马sfpq、抗氧化相关蛋白GST、HO-1、记忆相关蛋白p-CREB表达水平明显下调,海马CAT、SOD、GSH-PX等抗氧化酶的活性明显降低。（3）海马过表达Gαq明显改善了衰老模型小鼠学习记忆能力,上调了海马sfpq、GST、HO-1、p-CREB、抗凋亡蛋白BCL-2的表达水平,增强了衰老模型小鼠海马CAT、SOD、GSH-PX等抗氧化酶的活性。[结论]（1）小鼠海马中Gαq、sfpq随年龄增加而逐渐减少,衰老模型小鼠海马过表达Gαq后sfpq明显上调,提示Gαq、sfpq二者在神经衰老和抗神经衰老过程中存在内在调控关系。（2）海马过表达Gαq可明显改善衰老模型小鼠的学习记忆能力,Gaq可作为体内抗神经衰老的治疗靶点。（3）海马过表达Gαq可以恢复sfpq,和抗氧化蛋白GST、HO-1表达水平,增强CAT、SOD、GSH-PX等抗氧化酶的活性,减少神经元凋亡并增加记忆相关蛋白p-CREB含量从而改善衰老模型小鼠的学习记忆能力。

关键词：海马 Gαq sfpq 过表达衰老小鼠

超保守RNA uc.12+A在伯基特淋巴瘤中的作用研究

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超保守RNA uc.12+A在伯基特淋巴瘤中的作用研究

作者：华婧扬州大学

学位级别：硕士

目的B细胞淋巴瘤是一种发生于淋巴结及其它淋巴组织的肿瘤,它分为两类,即霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。本文的主要研究对象为非霍奇金淋巴瘤。c-Myc基因是一种原癌基因,能够促进DNA的修复以及调节细胞周期,从而影响细胞的增... 详细信息

目的B细胞淋巴瘤是一种发生于淋巴结及其它淋巴组织的肿瘤,它分为两类,即霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。本文的主要研究对象为非霍奇金淋巴瘤。c-Myc基因是一种原癌基因,能够促进DNA的修复以及调节细胞周期,从而影响细胞的增殖、分化和凋亡。近年来,越来越多的研究表明,c-Myc基因在非霍奇金淋巴瘤的发生、发展以及治疗中发挥着重要的作用。课题组前期构建了 c-Myc诱导表达的B细胞淋巴瘤模型,并通过芯片技术检测超保守区域转录本(Transcribed ultraconserved regions,T-UCRs)在c-Myc激活和失活状态下的差异表达,发现其中有几种T-UCRs表达量有明显差异,其中一个就是uc.12+A。本课题旨在通过研究uc.12+A对B细胞淋巴瘤生长的影响,并进一步探讨其机制与作用。方法1.首先,构建Myc-on和Myc-off的小鼠B细胞淋巴瘤模型,运用芯片检测表达水平发生显著变化的T-UCRs,确定研究对象为uc.12+A。利用普通RT-PCR与链特异性RT-PCR检测uc.12+A在B淋巴瘤细胞系中的表达水平,观察其结果是否与芯片检测结果一致。***.12+A过表达逆转录病毒质粒的构建:根据UCbase数据库获取uc.12+A的基因序列,PCR扩增该基因序列,并选择逆转录病毒pMSCV-PIG载体,将目的基因通过双酶切构建到载体中,获得含有目的基因的重组质粒,对于测序正确的重组质粒,提取和纯化高质量的重组质粒。3.细胞转染与感染:将构建好的质粒uc.12+A-pMSCV-PIG通过PEI转染法转染到293T细胞中,收集36 h、48 h、60 h、72 h的含病毒的上清液,细胞感染备用。用含病毒的上清液分别感染38B9细胞和Romas细胞,并用polybrene增强感染率,48h后取适量细胞,运用流式细胞术测感染率,随后用puromycin进行筛选,直到感染率达到80%以上。4.体外和体内实验:将感染后细胞分为两个组,MSCV对照组及过表达uc.12+A组。运用细胞计数法检测过表达uc.12+A对B淋巴瘤细胞增殖的影响,共计数四天,并作折线分析;运用流式细胞技术检测过表达uc.12+A对B细胞淋巴瘤的细胞周期和凋亡的影响;将过表达uc.12+A和MSCV对照组的细胞分别注入小鼠皮下,12天后取肿瘤组织并比较其大小和重量,以观察过表达uc.12+A对B细胞淋巴瘤生长的影响。5.通过生物学网站查找uc.12+A的宿主基因,确定其宿主基因为sfpq(脯氨酸谷氨酰胺富含性剪切因子),通过RT-PCR检测sfpq在过表达uc.12+A的38B9及Romas细胞中的mRNA表达水平,并与MSCV对照组对比;运用Western-blot检测sfpq在过表达uc.12+A的38B9及Romas细胞中的蛋白表达水平,同样与MSCV对照组进行对比。结果***-PCR结果显示,在38B9和myc3细胞中,uc.12+A的表达明显高于在小鼠骨髓B细胞中的表达,与芯片检测结果一致。运用普通PCR及链特异性PCR检测uc.12+A的表达情况,对比发现,两组总体趋势一致,即uc.12+A的表达在淋巴瘤细胞中都呈增高趋势,但链特异性PCR组的表达明显低于普通RT-PCR检测组,说明链特异性PCR检测uc.12+A的表达水平结果更准确,能排除顺义链对检测结果的干扰。2.细胞体外计数结果显示,过表达uc.12+A的细胞增殖速度高于MSCV对照组,说明过表达uc.12+A后,B细胞淋巴瘤增殖速度加快;细胞周期实验表明,过表达uc.12+A后,S期细胞比例增高,提示细胞增殖分裂旺盛;细胞凋亡实验显示,过表达uc.12+A后,细胞凋亡率下降;小鼠体内荷瘤实验显示,过表达uc.12+A的细胞在小鼠体内生长速度加快。以上实验均说明过表达uc.12+A能促进B细胞淋巴瘤的生长。***-PCR结果显示,在过表达uc.12+A的情况下,sfpq的表达水平同样升高,两者呈正相关趋势;Western-blot检测过表达uc.12+A组与MSCV对照组的sfpq蛋白表达水平显示,过表达uc.12+A时,sfpq的蛋白表达水平也相应增高,趋势与RT-PCR检测结果一致。结论***.12+A在B细胞淋巴瘤中表达增高,在体内和体外,它都能起到促进B淋巴瘤细胞生长的作用。***作为uc.12+A的宿主基因,其表达水平的变化与uc.12+A的表达呈正相关趋势。

关键词： B细胞淋巴瘤超保守RNA sfpq c-Myc基因