克氏原螯虾通过调节PcSnail的表达抵御WSSV感染的分子机制研究

作     者：范瑞雪 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：兰江风

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：克氏原螯虾 白斑综合征病毒 Snail Relish 先天免疫 

摘      要：克氏原螯虾(Procambarus clarkii)俗称小龙虾,是我国重要的水产养殖品种。随着克氏原螯虾养殖面积的无序扩大,疾病爆发给养殖户带来了严重的经济损失。其中,白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)感染造成了克氏原螯虾的大量死亡。锌指蛋白Snail在许多恶性肿瘤组织中高表达,并通过上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程促进癌细胞的扩散和转移。Snail在动物抵御病毒感染中的角色还有待进一步揭示。本研究从克氏原螯虾中鉴定得到一个Snail基因,命名为PcSnail,并探究了PcSnail在克氏原螯虾抵御WSSV感染中的作用,具体研究结果如下:PcSnail的c DNA全长1484 bp,开放阅读框为1197 bp,编码398个氨基酸。系统发育树分析结果显示,PcSnail与斑节对虾(Penaeus monodon)和南美白对虾(Litopenaeus vannamei)的Snail的亲缘关系较为接近。PcSnail蛋白的C末端含有五个经典的Cys2-His2(CH)-锌指结构域,通过多重氨基酸序列比对发现,该区段表现出较高的保守性。PcSnail在克氏原螯虾鳃和肠中的表达量较高,在病毒感染12 h内,其转录水平呈现下降趋势。为了研究PcSnail蛋白在克氏原螯虾抗病毒免疫中的功能,本研究利用RNAi技术对克氏原螯虾鳃和肠中的PcSnail进行干扰,结果显示:在干扰PcSnail的表达后,WSSV在鳃和肠中的复制水平有所下降。注射PcSnail重组蛋白使得WSSV在克氏原螯虾鳃中的拷贝量明显增加。以上结果预示着PcSnail参与了WSSV在克氏原螯虾体内的感染或者复制过程。为了探究PcSnail在病毒感染或复制过程中的角色,本研究在克氏原螯虾体内干扰PcSnail后,检测转录因子Relish的核易位变化。结果显示:在干扰PcSnail的表达后,Relish的入核水平减少。免疫细胞化学实验验证了此结果。在克氏原螯虾体内干扰Relish后,WSSV极早期基因ie1的表达水平下降。在干扰PcSnail的表达后,ie1的表达水平明显下降。综上所述,WSSV以未知的方式绑架宿主PcSnail,通过促进转录因子Relish进入细胞核,诱导其极早期基因ie1在宿主体内的转录。在WSSV感染的早期宿主通过减少PcSnail的表达应对WSSV的这种逃逸机制。本研究为克氏原螯虾应对WSSV的免疫逃逸提供了新的见解。