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柞蚕relish调控ATG5参与抗细菌的研究

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柞蚕Relish调控ATG5参与抗细菌的研究

作者：陈晨淮北师范大学

学位级别：硕士

昆虫先天免疫是抵御病原菌等入侵的关键过程。前期实验结果显示革兰氏阴性菌的细胞壁成分LPS诱导先天免疫过程中上调了多个自噬相关基因,表明细胞自噬与先天免疫存在一定的相互关系。本研究通过对柞蚕自噬相关基因5（ATG5）的克隆表达... 详细信息

昆虫先天免疫是抵御病原菌等入侵的关键过程。前期实验结果显示革兰氏阴性菌的细胞壁成分LPS诱导先天免疫过程中上调了多个自噬相关基因,表明细胞自噬与先天免疫存在一定的相互关系。本研究通过对柞蚕自噬相关基因5（ATG5）的克隆表达和分析,揭示其在革兰氏阴性菌入侵过程中的功能;通过对IMD信号通路关键转录因子relish与自噬相关基因的调控分析,探讨先天免疫与细胞自噬间的调控关系。研究结果如下:1.克隆了柞蚕ATG5基因,并对其进行了原核表达及抗血清制备。柞蚕ATG5基因全长5557 bp,包含4个内含子和五个外显子,其ORF为795 bp,编码264个氨基酸,包含一个APG5功能结构域。氨基酸序列分析表明柞蚕ATG5较为保守,与烟草天蛾、家蚕、棉铃虫等昆虫ATG5序列的同源性均超过90%。通过构建柞蚕ATG5的原核表达载体pET-28a（+）-ATG5,经原核表达后纯化了柞蚕ATG5重组蛋白、制备了多克隆抗血清并进行了验证。2.分析了ATG6、ATG12及ATG5在革兰氏阴性菌细胞壁成分LPS刺激后的表达模式。LPS注射柞蚕诱导其先天免疫后,ATG6、ATG12及ATG5在柞蚕脂肪体中均呈现显著的上调表达。自噬相关基因的上调可能参与柞蚕对革兰氏阴性菌的先天免疫过程。3.研究了柞蚕ATG5参与柞蚕抵御革兰氏阴性菌先天免疫过程的功能。对ATG5 RNAi的柞蚕注射胞内入侵型革兰氏阴性菌-福氏志贺氏菌后,血液中细菌的菌落形成单位（CFU）有几十倍的显著升高,柞蚕的存活率明显降低。构建过表达载体,在Bm N细胞中对ATG5-GFP及ATG12-mCherry进行过表达。与自噬激活剂Rapamycin的结果类似,过表达细胞在孵育LPS后GFP与mCherry的共定位荧光增强,荧光点数目增加,表明ATG5及ATG12在受到LPS刺激后激活参与自噬对革兰氏阴性菌的先天免疫过程。4.揭示了relish可调控自噬相关基因的转录表达参与先天免疫过程。柞蚕relish RNAi后,ATG6及ATG8的转录水平在relish干扰24 h后出现了显著的下调表达。relish RNAi的柞蚕经LPS免疫刺激后,ATG5的转录水平及蛋白水平均显著降低。表明先天免疫诱导后通过激活relish,从而调控ATG5的转录表达参与对病原菌的抵御过程。5.验证了转录因子relish的N端Rel结构域（Rel-N）对ATG5的转录调控。在ATG5基因上游的启动子区域发现了四个潜在的NF-κB转录因子结合位点,分别位于ATG5基因上游630 bp、774 bp、1858 bp及2071 bp处。将ATG5启动子构建萤火虫荧光素酶报告基因载体,并在细胞内过表达Rel-N。双荧光素酶活性实验结果显示共转染Rel-N及ATG5启动子的实验组表现出更高的相对荧光素酶活性,表明relish的Rel结构域可结合于ATG5启动子,调控其转录表达。本研究揭示了柞蚕在先天免疫抵御革兰氏阴性菌的过程中,通过NF-κB转录因子relish调控ATG5的转录表达,激活细胞自噬过程参与对病原菌的清除等作用以维持自身生存。相关研究可丰富昆虫的先天免疫研究,加深对细胞降解过程参与先天免疫稳态的理解。

关键词：柞蚕先天免疫细胞自噬 ATG5 relish

转录因子relish在斑节对虾不同发育阶段的表达分析

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广东农业科学 2012年第12期39卷 3-7页

作者：刘文静杨丽诗杨其彬李晓兰苏天凤江世贵中国水产科学研究院南海水产研究所/农业部南海渔业资源开发利用重点实验室广东广州510300 上海海洋大学水产与生命学院上海201306 华南农业大学动物科学学院广东广州510642

对克隆获得的转录因子NF-κB/Rel家族成员relish基因在斑节对虾发育阶段的表达特征进行分析。所获的Pmrelish是relish基因的亚型之一,与凡纳滨对虾Lvrelish高度相似,结构域组成相同,其中RHD、IPT和DD结构域均具有100%的同源性,ANK结构... 详细信息

对克隆获得的转录因子NF-κB/Rel家族成员relish基因在斑节对虾发育阶段的表达特征进行分析。所获的Pmrelish是relish基因的亚型之一,与凡纳滨对虾Lvrelish高度相似,结构域组成相同,其中RHD、IPT和DD结构域均具有100%的同源性,ANK结构域的相似性也高达97.7%。NF-κB/Rel家族进化树分析显示,Pmrelish与对虾、昆虫等节肢动物的relish聚为一支,并与P105(NF-κB1)和P100(NF-κB2)最为相近。Pmrelish的表达在4个幼体发育时期都存在显著性差异,其中糠虾阶段表达量最高。Pmrelish在不同发育阶段的精巢和卵巢中的表达特征相似,即未成熟期的表达相对较低,其中Pmrelish在10～12 cm体长雄虾精巢中表达量最高,卵巢中的表达则在成熟期(V期)最高,为卵原细胞期的14.3倍。

关键词：斑节对虾 NF-κB/Rel relish 发育阶段荧光定量PCR

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relish参与家蚕自噬调控的初步研究

Relish参与家蚕自噬调控的初步研究

作者：韩勇华南农业大学

学位级别：硕士

家蚕（Bombyx mori）是完全变态发育昆虫,在变态发育时期要经历剧烈的生理变化,发生着旧组织的退化、消亡以及新组织的产生。细胞自噬（Autophagy）是众多影响家蚕变态发育时期组织退化的因素之一。唾液腺是已知大多数动物分泌唾液润滑... 详细信息

家蚕（Bombyx mori）是完全变态发育昆虫,在变态发育时期要经历剧烈的生理变化,发生着旧组织的退化、消亡以及新组织的产生。细胞自噬（Autophagy）是众多影响家蚕变态发育时期组织退化的因素之一。唾液腺是已知大多数动物分泌唾液润滑口腔的主要器官,这一功能对动物进食起重要的辅助作用。relish作为NF-κB转录因子家族中的一员,具有调控抗菌肽（antimicrobial peptide,AMP）转录的功能。最近在果蝇中的研究表明relish也参与细胞自噬的调控,其调控作用是通过上调调控自噬相关基因（Autophagy-related,Atg）Atg1的表达而实现的。为了研究relish在家蚕变态发育时期对细胞自噬的调控作用,本论文在克隆家蚕relish基因的基础上,通过家蚕变态发育期Bmrelishs、Atgs、AMPs等基因的表达分析和Bmrelishs基因过表达的功能分析,研究relish参与自噬的调控作用,为探讨变态发育期先天免疫和细胞自噬的相互作用关系奠定基础。论文获得的主要研究结果如下:（1）根据报道的家蚕Bmrelish1（NM＿001102465.1）与Bmrelish2（NM＿001105234.1）序列,从大造品种的家蚕幼虫脂肪体对Bmrelishs基因进行RT-PCR扩增,获得了两条Bmrelish1序列。保守结构域分析显示:两条序列中均含有Rel蛋白同源结构域（Rel homology domain,RHD）及锚蛋白重复序列（ankyrin repeat,ANK）,属于Bmrelish1的两个亚型。将c DNA全长为2784bp的Bmrelish1命名为Bmrelish1-a,与报道的Bmrelish1氨基酸序列一致性高达97.26%;另一条命名为Bmrelish1-b,为2241bp,与报道的Bmrelish1氨基酸序列一致性为78.43%。扩增得到的Bmrelish2与报道的序列（NM＿001105234.1）一致。（2）通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）检测家蚕五龄幼虫至蛹变态发育时期脂肪体、中肠和唾腺中的Bmrelishs的表达量,结果显示:在变态发育时期,脂肪体、中肠和唾腺中Bmrelish1-（a+b）、Bmrelish1-a及Bmrelish2表达量均有显著上调,尤其是唾腺中最为明显。五龄幼虫期唾腺中relishs的表达水平低,relish1在预蛹期和蛹期1d表达量达到高峰,之后在蛹期2d急剧下降;而relish2在蛹期2d表达量升高。（3）qPCR检测幼虫至蛹变态期唾腺中自噬相关基因（Atgs）和抗菌肽（AMPs）的表达,发现在唾腺中Atgs基因在化蛹变态发育时期随着发育进程而增加,在预蛹期和蛹期1d达到峰值,蛹期2d表达急剧下降至很低的水平;AMPs基因在预蛹期、化蛹初期出现表达量上调。与唾腺中relish基因在变态发育期的上调趋势相似,猜测relish的上调与变态发育时期的免疫或自噬等生理过程有关。（4）对家蚕五龄幼虫至蛹变态发育时期的唾腺进行形态观察,发现从预蛹期开始家蚕唾腺发生萎缩,且组织变的松散,表明此时的唾腺开始发生组织降解和退化。激光共聚焦扫描显微镜观察唾腺的Lyso Tracker Red染色结果显示,从预蛹期1天开始检测到红色荧光亮点,并在预蛹期2天红色荧光最强,说明家蚕唾腺从游走期开始发生细胞自噬,并在预蛹期2天达到较高水平。（5）将Bmrelish1-a、Bmrelish1-b、激活型relish1和relish2插入p IEx4表达载体,构建获得的重组表达载体转染Bm N细胞,Western blot检测表明Bmrelish在Bm N细胞中成功表达。通过qPCR检测发现,过表达Bmrelish1-a及Bmrelish2使Atg5、Atg7、Atg12等基因的表达量上调。上述研究结果初步表明家蚕relish转录因子具有参与自噬的调控功能,暗示了在家蚕变态发育期自噬和免疫通路之间可能通过共同的调控因子relish发生相互调节的作用。

关键词：家蚕唾腺 relish 自噬自噬相关基因抗菌肽

Characterization of the Bombyx mori Cecropin A 1 promoter regulated by IMD pathway

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Insect Science 2016年第2期23卷 297-304页

作者： Xiao-Ting Hua Xiao-Juan Ma Ren-Ju Xue Ting-Cai Cheng Fei Wang Qing-You Xia State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology Southwest University Chongqing 400716 China

Cecropin A1 （CeeA1） promoter from Bombyx mori was cloned and character- ized to provide insight into the transcriptional control of this antimicrobial peptide gene upon immune challenges. Reporter gene assays demonstrated that both Escherichia coli and lipopolysaccharide could induce expression in BmE cells but B. bombyseptieus or peptidoglycan failed, and the induction pattern of the reporter gene was coincident with the endogenous CecAl. Analysis of deletion and mutation constructs revealed that the regulatory region was the κB motif located between -176 and -166, and no other pre- dicted elements on CecAl promoter affected its inducibility. Insertion of additional κB motifs increased the activity of CecAl promoter. Furthermore, binding of relish to lob motif was confirmed by electrophoretic mobility shift assay. These findings indicate the regulatory mechanism of CecAl expression in IMD pathway and suggest an approach of engineering antimicrobial peptide promoter with enhanced activities that may lead to broad applications.

关键词： Bombyx mori Cecropin A1 promoter immune challenges κB motif relish

relish、Toll和Pellino在克氏原螯虾先天免疫中的功能研究

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Relish、Toll和Pellino在克氏原螯虾先天免疫中的功能研究

作者：张卓星南京师范大学

学位级别：硕士

克氏原螯虾(Procambarus clarkii),俗称红螯虾、淡水小龙虾,在上世纪三十年代传入我国,随后几十年内凭借其较强的适应力、生长力迅速、肉质鲜美和营养价值高等诸多优点占据了我国淡水养殖虾类产业的重要地位,并成为全世界商品价值最高... 详细信息

克氏原螯虾(Procambarus clarkii),俗称红螯虾、淡水小龙虾,在上世纪三十年代传入我国,随后几十年内凭借其较强的适应力、生长力迅速、肉质鲜美和营养价值高等诸多优点占据了我国淡水养殖虾类产业的重要地位,并成为全世界商品价值最高的虾类之一。但近年来,随着克氏原螯虾需求量的不断增加,其养殖规模和养殖密度也不断扩大,诱使各种致病微生物带来的病害频繁发生,严重威胁了克氏原螯虾养殖产业的健康发展,并带来了巨大的经济损失。克氏原螯虾属于无脊椎动物,缺乏适应性免疫系统,仅依靠先天性免疫系统来抵御病原微生物的入侵。因此,对克氏原螯虾先天免疫机制的研究对病害防治尤为重要。本课题对relish,Toll和Pellino等几种重要的免疫因子在克氏原螯虾先天免疫中的作用进行了研究,并得到以下结果:1、核转录因子NF-κB在无脊椎动物的先天免疫中起着关键作用,relish即是NF-κB家族中的一员。从克氏原螯虾(P.clarkii)中鉴定出两种relish亚型(SPc relish和LPc relish)并对它们进行了功能分析。长亚型LPc relish由完全剪接产生,包含25个外显子和24个内含子,c DNA全长4961bp,编码包含1187个氨基酸的蛋白质;而短亚型SPc relish由内含子保留的可变剪接产生,包含外显子1-9以及保留了内含子9,c DNA全长2696bp,编码由418个氨基酸组成的多肽。LPc relish蛋白包含Rel同源结构域(RHD)、ig样结构域、丛蛋白、IPT结构域和锚蛋白(ankyrin,ANK)重复序列抑制结构域。然而,SPc relish只包含RHD和IPT结构域,没有ANK结构域。副溶血性弧菌感染克氏原螯虾可以调控其体内SPc relish和LPc relish的转录。另外,将SPc relish基因干扰后,再用副溶血弧菌感染虾体,发现有一些抗菌肽(ALF-7032、ALF-13162和Crustin-42012)的表达明显减少抑制,而另一些抗菌肽(ALF-41125、ALF-42430、Crustin-41354和Crustin-42993)的表达明显增加。与SPc relish有所不同,将LPc relish基因沉默后,再用副溶血弧菌感染虾体,发现除ALF-41125基因外,以上所有受试抗菌肽的表达均被抑制。这些结果表明由可变剪接产生的两种relish亚型可能作为机体免疫系统的重要机制来促进免疫因子的多样性,进而导致relish转录因子免疫功能的多样性。2、Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)是参与先天免疫的一类重要分子。在克氏原螯虾中克隆得到三种新的Toll基因(Pc Tolla、Pc Tollb和Pc Tollc)。q RT-PCR分析表明这三个Toll基因均广泛分布于雌性和雄性克氏原螯虾的多种免疫组织,并在雌雄克氏原螯虾的肠道中表达量最高。在白斑综合症病毒(WSSV)刺激后,肠道中Pc Tolla、Pc Tollb和Pc Tollc三种Toll基因的表达均显著上调。将Pc Tolla、Pc Tollb和Pc Tollc基因敲低后,再用WSSV刺激虾体,结果显示这三个Toll基因可以调控多种抗菌肽基因的表达。其中,Pc Tolla能够调控克氏原螯虾肠道中ALF-7032、ALF-9228、ALF-42430、Crustin-42012和Crustin-42993的表达;Pc Tollb能够调控ALF-13162、ALF-9228、ALF-42430、Crustin-41354和Crustin-42993的表达;Pc Tollc能够调控ALF-13162、ALF-9228、ALF-41125、Crustin-42012、Crustin-41354和Crustin-42993的表达。以上研究表明克氏原螯虾的Pc Tolla、Pc Tollb和Pc Tollc基因在克氏原螯虾对抗WSSV侵染的过程中作为模式识别受体参与调控抗菌肽的表达,并发挥重要作用。3、Pellino作为E3泛素连接酶,在先天性免疫反应中同样发挥着不可或缺的作用。在克氏原螯虾中鉴定到一个新的Pellino基因(命名为Pc Pellino)。该基因的c DNA序列全长为1872 bp,包括1305 bp的开放阅读框(ORF),编码由434个氨基酸组成的蛋白质,且该蛋白质包含低复杂度区域和Pfam:Pellino结构域。组织分布分析表明,Pc Pellino广泛分布于克氏原螯虾的所有受试组织,并在鳃和肠道中表达量相对较高。在细菌(副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌)和白斑病毒(WSSV)感染后,Pc Pellino在鳃和肠道中的表达量均显著上调。将Pc Pellino基因干扰后,再分别用副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和WSSV感染虾体,随后检测多种抗菌肽基因的转录水平。结果显示,在克氏原螯虾鳃组织中,副溶

关键词：克氏原螯虾先天免疫 relish Toll Pellino 抗菌肽细菌感染 WSSV感染

斑节对虾TLR22及relish基因的克隆与表达分析

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斑节对虾TLR22及Relish基因的克隆与表达分析

作者：刘文静上海海洋大学

学位级别：硕士

斑节对虾(Penaeus monodon)是我国重要的海水养殖经济品种。近年来，疾病爆发、种质资源退化和养殖环境污染导致对虾在养殖过程中出现高死亡率，造成了巨大经济损失，成为制约对虾养殖业可持续健康发展的瓶颈之一。因此，从斑节对虾免... 详细信息

斑节对虾(Penaeus monodon)是我国重要的海水养殖经济品种。近年来，疾病爆发、种质资源退化和养殖环境污染导致对虾在养殖过程中出现高死亡率，造成了巨大经济损失，成为制约对虾养殖业可持续健康发展的瓶颈之一。因此，从斑节对虾免疫系统入手，发掘和分析免疫相关的基因，研究其免疫调控规律，探讨其抗病机理，提高虾体抗病能力，并为进一步筛选抗病基因，从基因水平进行品种改良提供理论依据。本研究克隆了免疫信号通路的关键因子—TLR22基因和relish基因，并探索其表达调控机制。同时，本实验还对relish基因在斑节对虾发育过程中的作用进行了初步研究。 TLR22是Toll样受体家族中重要的一员。Toll样受体的发现是20世纪以来宿主天然免疫系统的最大进展。Toll属于模式识别受体(PRR)，通过胞外区的LRR结构域特异性识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)，启动细胞内信号转导通路，诱导干扰素、炎症因子等抗炎症因子表达。获得斑节对虾TLR22(以下简称PmTLR22)基因为3680bp，包含3045bp的ORF，可编码1014个氨基酸。PmTLR22蛋白由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成。其胞外区含有12个亮氨酸重复(LRRs)，胞内具有相对保守的Toll/白介素1受体结构域（Toll/IL-1R, TIR）。PmTLR22胞外的LRRs在第4个亮氨酸残基（L）高度保守。TLR22在进化上更趋于TLR3。实时定量荧光PCR显示在所检测的11种组织中，PmTLR22的mRNA在肝胰腺的表达最高，其次为肠、胃。使用定量PCR检测肝胰腺PmTLR22在不同免疫刺激条件下的mRNA表达情况，结果显示肝胰腺TLR22可被白斑综合征病毒（WSSV）和创伤弧菌诱导表达，而金黄色葡萄球菌不能诱导该基因表达。其中WSSV感染24h，PmTLR22显著上调表达23倍，创伤弧菌感染后6h和9h显著上调PmTLR22表达。进一步，证明了病毒核酸类似物Poly（I:C）及R484均可激活PmTLR22的表达，说明病毒PAMP对PmTLR22具有诱导表达作用，PmTLR22可能是识别PAMP的模式识别分子。获得PmTLR22胞外段的重组融合蛋白，其大小约为58kDa，为进一步研究其功能提供基础。 relish是NF-κB家族成员之一。Rel/NF-κB是大部分信号转导的中枢，调控机体的先天性免疫应答、炎症反应、细胞增殖和分化、细胞凋亡等重要的病理和生理过程。本研究在构建的斑节对虾肝胰腺cDNA文库中克隆得到NF-κB的家族成员之一relish，命名Pmrelish，其全长5112bp，包括3561bp的ORF，推测编码一个含1186个氨基酸的蛋白。Pmrelish的蛋白具有Rel/NF-κB蛋白家族的典型结构特征，包括N端的RHD结构域，核定位信号，C端的6个锚蛋白重复序列以及死亡结构域，表明该蛋白是NF-κB1亚型。同源性分析显示斑节对虾Pmrelish与凡纳滨对虾Lvrelish及短小亚型Lvrelish-S的RHD结构域序列完全一致，进化上也与之关系最近。该基因在所检测组织中组成型表达，并在血细胞表达量最高。使用定量PCR检测肝胰腺Pmrelish在不同免疫刺激条件下的mRNA表达情况，结果显示肝胰腺relish基因是诱导型表达，并被创伤弧菌、金黄色葡萄球菌和WSSV调控表达，其中被创伤弧菌上调表达最显著。进一步，证明了病毒核酸类似物Poly（I:C）及R484可激活Pmrelish的表达。上述研究说明relish是斑节对虾的重要免疫因子，可能通过直接或间接作用参与对细菌和病毒的免疫反应。此外，研究了Pmrelish在斑节对虾的发育过程中的表达情况。结果显示Pmrelish表达在幼体发育四个时期都存在显著性差异，其中糠虾阶段表达量最高;Pmrelish在不同发育阶段的精巢和卵巢中的表达特征相似，即未成熟期的表达相对较低，其中Pmrelish在10-12cm体长雄虾精巢中表达量最高，卵巢中的表达则在成熟期（V期）最高，为卵原细胞期的14.3倍。这说明Pmrelish在斑节对虾的发育过程中也可能起着重要作用。

关键词：斑节对虾 TLR22 relish 先天性免疫基因克隆表达分析

三种生防细菌侵染对亚洲玉米螟幼虫转录因子relish基因表达的影响

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三种生防细菌侵染对亚洲玉米螟幼虫转录因子Relish基因表达的影响

作者：唐泰扬州大学

学位级别：硕士

亚洲玉米螟是为害玉米的重要粮食害虫,采用生防细菌控制亚洲玉米螟危害是重要的害虫综合治理方法之一。本研究采用RACE的方法克隆了亚洲玉米螟幼虫免疫相关基因转录因子relish基因;采用3种生防细菌铜绿假单胞菌、藤黄微球菌和苏云金芽... 详细信息

亚洲玉米螟是为害玉米的重要粮食害虫,采用生防细菌控制亚洲玉米螟危害是重要的害虫综合治理方法之一。本研究采用RACE的方法克隆了亚洲玉米螟幼虫免疫相关基因转录因子relish基因;采用3种生防细菌铜绿假单胞菌、藤黄微球菌和苏云金芽孢杆菌,通过注射或喂饲的方法处理了亚洲玉米螟幼虫,研究了 3种昆虫致病菌对relish基因和4种抗菌肽Cecropin A、Gloverin、Moricin和Attacin基因表达的影响;采用RNA干扰技术研究了relish基因的表达调控机理。本研究为探索relish基因的功能打下了基础,为进一步开发昆虫免疫调剂类农药提供了理论依据。主要研究结果如下:采用3’-RACE和5’-RACE技术,获得了亚洲玉米螟幼虫relish基因的全长cDNA序列。该基因全长3165 bp,包含一个 2882bp的开放阅读框(ORF),起始密码子为ATG,终止密码子为TAG,编码956个氨基酸,包括一个153 bp的5’非编码区(5’UTR)和一个81 bp的3’非编码区(3’UTR)。生物信息学预测分析表明:Of-relish基因编码蛋白的计算分子量约为98 kDa,无跨膜结构域,2个糖基化位点,101个磷酸化位点,为亲水性蛋白。三维结构显示,有4个α螺旋,16个β折叠。对亚洲玉米螟4龄幼虫分别注射了铜绿假单胞菌和藤黄微球菌后,利用荧光定量PCR技术,检测了幼虫体内转录因子Of-relish和4种抗菌肽Cecropin A、Gloverin、Moricin及Attacin基因的表达情况。结果表明:与对照组相比,铜绿假单胞菌或藤黄微球菌侵染后,亚洲玉米螟体内的Of-relish及4种抗菌肽基因表达水平明显上升(Prelish基因调控4种抗菌肽基因表达,从而产生免疫防御反应。采用RNA干扰技术,给亚洲玉米螟3龄幼虫注射了 dsRNA-relish后发现在84h、96h、108h、120 h时,Of-relish基因表达分别下调至对照组的42.08%、42.61%、47.69%、64.85%,证明Of-relish基因在此期间被成功干扰;干扰Of-relish基因并同时分别注射铜绿假单胞菌和藤黄微球菌,结果表明:相对于单独注射细菌,Of-relish和 4 种抗菌肽CecropinA、Gloverin、Moricin及Attacin基因都被明显抑制。说明了Of-relish可调控4种抗菌肽基因的表达。采用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Kurtaki,Bt),将Bt与人工饲料混合后饲喂亚洲玉米螟4龄幼虫。实时荧光定量PCR检测表明:Of-relish及Cecropin A、Gloverin、Moricin及Attacin的表达水平明显上升,说明喂饲Bt也可诱导亚洲玉米螟Of-relish基因调控4种抗菌肽基因表达,产生免疫防御反应。

关键词：亚洲玉米螟 relish 抗菌肽铜绿假单胞菌藤黄微球菌苏云金芽孢杆菌 RNAi 荧光定量PCR 基因表达

Bursicons、relish和LGR2在日本沼虾先天免疫中的功能研究

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Bursicons、Relish和LGR2在日本沼虾先天免疫中的功能研究

作者：曹雪颖南京师范大学

学位级别：硕士

日本沼虾(Macrobrachium nipponense),又名河虾、青虾,广泛分布于我国和一些亚洲国家的部分淡水湖泊中。日本沼虾有分布广泛和适应性强等特性,在我国淡水经济生物养殖产业中占有重要地位,是我国最重要的淡水养殖品种之一。近年来,由于... 详细信息

日本沼虾(Macrobrachium nipponense),又名河虾、青虾,广泛分布于我国和一些亚洲国家的部分淡水湖泊中。日本沼虾有分布广泛和适应性强等特性,在我国淡水经济生物养殖产业中占有重要地位,是我国最重要的淡水养殖品种之一。近年来,由于集约化养殖的发展,日本沼虾病害频发,而日本沼虾是无脊椎动物,缺乏特异性免疫,仅有先天免疫系统来抵抗病害,因此对日本沼虾先天免疫机制的研究十分重要。本课题研究了Bursicon、relish和LGR2三种重要的可能与免疫相关的基因在日本沼虾体内的免疫功能,并得到以下结果:1、Bursicon是一种与蜕皮相关的神经肽类激素,有研究发现它在无脊椎动物先天免疫中起到重要作用,本论文的研究集中在Bursicon基因在日本沼虾先天免疫中的作用。我们通过同源克隆分别得到日本沼虾体内的Mn Burcison两个亚基(Mn Bursicon-α和Mn Bursicon-β)的全长序列。本研究对两个亚基分别进行讨论,Mn Bursicon-α序列全长959 bp,其中开放阅读框为444 bp,包含147个氨基酸;Mn Bursicon-β序列全长1370 bp,其中开放阅读框为414 bp,包含137个氨基酸。Mn Bursicon-α和Mn Bursicon-β分别编码Mn Bursicon-α蛋白和Mn Bursicon-β蛋白,蛋白结构域均包含1个信号肽和1个C端胱氨酸结结构域(CTCK)。Mn Bursicon-α主要表达在肝胰腺、血细胞和肠中,在心、胃和鳃中表达量较低,而Mn Bursicon-β主要表达在肝胰腺、胃和肠中,在鳃、心和血细胞中表达量较低。在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和白斑综合症病毒(WSSV)的感染下,虾的鳃和胃组织中Mn Bursicon-α和Mn Bursicon-β的表达量均呈现不同程度的上调。将基因Mn Bursicon-α和Mn Bursicon-β分别敲低,再分别检测抗菌肽的表达,发现6种抗菌肽表达被抑制(Mn Cru1、2、3和Mn ALF1、2和Mn Car1)。同时,分别注射牛血清蛋白,Bursicon-α和Bursicon-β的重组蛋白,再次检测抗菌肽表达,发现与对照组相比,6种同样的抗菌肽(Mn Cru1、2、3和Mn ALF1、2和Mn Car1)表达量升高。由此,我们认为Mnburcison通过调控抗菌肽的表达参与了日本沼虾的先天免疫过程。2、relish是IMD信号通路下游的转录因子,属于NF-κB蛋白家族,在入核调控抗菌肽表达中发挥重要作用。我们通过克隆得到Mn relish在日本沼虾体内的全长序列,通过研究发现Mn relish序列全长5082 bp,其中开放性阅读框长3549bp,编码1182个氨基酸的肽链。蛋白包含1个N端的Rel同源结构域(RHD),1个IPT结构域,4个低密度结构域,6个锚蛋白重复和1个卷曲螺旋区域。Mn relish在鳃组织中表达量最高,其次是血细胞和肝胰腺,在心、胃和肠组织中表达量较低。在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和WSSV的感染下,虾的鳃和胃组织中Mn relish的表达量呈现不同程度的上调。将基因Mn relish敲低后,检测抗菌肽表达发现5种抗菌肽(Mn Cru1,Mn Cru2,Mn Cru6,Mn ALF1和Mn ALF2)表达下调。同时,敲低Mn relish基因后分别注射牛血清蛋白,Bursicon-α/β的重组蛋白。实验结果发现,敲低Mn relish基因后,与注射牛血清蛋白相比,注射Bursicon-α/β重组蛋白组有3种抗菌肽(Mn Cru1,Mn ALF1和Mn ALF3)表达明显下调。由此,我们认为Mn relish是调控抗菌肽表达的重要转录因子,参与了日本沼虾先天免疫的过程。3、LGR是一种富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体,属于一种膜结合受体。我们在日本沼虾体内通过同源克隆得到一个LGR的的全长序列,通过生物学分析发现属于B型LGR,命名为Mn LGR2。Mn LGR2序列全长5921 bp,其中开放性阅读框为4515 bp,编码1504个氨基酸的肽链。蛋白含有1个七次跨膜结构域、12个富含亮氨酸的重复序列和5个低密度序列区域。Mn LGR2在鳃组织中表达量最高,在胃、心、肠、肝胰腺和血细胞中表达量均不高。在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和WSSV的感染的虾中,Mn LGR2表达量均呈现不同程度的变化。将该基因敲低后检测抗菌肽的表达,发现5种抗菌肽表达量升高(Mn Cru1,Mn Cru2,Mn Cru6,Mn ALF1和Mn ALF2),同时检测Mn relish的表达量,发现Mn relish的表达量在Mn LGR2表达被抑制时反而升高。敲低基因Mn LGR2后我们检测了pro PO通路相关基因的表达量,发现4种pro PO通路相关基因(Mn PPAE1、2、3和Mn PPAF)的表达量

关键词：日本沼虾先天免疫 Bursicon relish LGR2 抗菌肽酚氧化酶活性

罗氏沼虾IMD信号通路关键基因（relish、IMD）的克隆和功能研究

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罗氏沼虾IMD信号通路关键基因（Relish、IMD）的克隆和功能研究

作者：史晏如南京师范大学

学位级别：硕士

免疫缺陷同系物(IMD)信号通路在无脊椎动物先天免疫中发挥重要的作用。IMD和relish是IMD信号通路中2个关键的组分。本课题以罗氏沼虾为研究对象,从罗氏沼虾克隆到一个relish(Mrrelish)和一个IMD (MrIMD)基因,并对他们在先天免疫中的功... 详细信息

免疫缺陷同系物(IMD)信号通路在无脊椎动物先天免疫中发挥重要的作用。IMD和relish是IMD信号通路中2个关键的组分。本课题以罗氏沼虾为研究对象,从罗氏沼虾克隆到一个relish(Mrrelish)和一个IMD (MrIMD)基因,并对他们在先天免疫中的功能进行了初步研究。Mrrelish的cDNA全长为5072 bp,包含一个3510 bp的开放阅读框,编码1169个氨基酸。MrIMD的cDNA全长为744 bp,其开放阅读框为551bp,编码184个氨基酸。构建的系统进化树表明,Mrrelish和其他来源于甲壳类动物的relish蛋白属于同一个分支。在mRNA水平上,Mrrelish广泛分布于罗氏沼虾的多种组织,包括血细胞、心脏、肝胰腺、鳃、胃和肠道中,并在血细胞和肠道中具有相对较高的表达水平。MrIMD转录本也广泛分布于心脏、肝胰腺、鳃、胃和肠道中,MrIMD在鳃组织中表达量最高。Mrrelish在鳃组织中,受鳗弧菌刺激6小时后,表达上调。受白斑综合症病毒(WSSV)病毒刺激后,MrIMD在鳃中的表达水平随着感染时间的延长而逐渐升高,并在病毒刺激48小时后达到最高值;而在肝胰腺中,MrIMD受WSSV刺激24小时后达到最高。MrIMD在肝胰腺中,受嗜水气单胞菌刺激6小后达到最高。在果蝇S2细胞中,分别过表达Mrrelish和MrIMD后,抗菌肽Metchnikowin (Mtk), Attacin (Atta), Drosomycin (Drs), Cecropin (CecA)和Penaeidin (Pen4)均可以诱导表达。在罗氏沼虾鳃组织中,对Mrrelish进行RNA干扰后,抗菌肽Crustin (Cru)2, Cru5, CrU8, lysozyme (Lyso)1和Lysol的表达受到了一定的抑制,而抗脂多糖因子ALF1和ALF3的表达并未受到影响。总之,对IMD免疫信号通路中的2个关键组分relish和IMD的功能进行初步研究后,表明IMD信号通路参与了罗氏沼虾抗细菌,抗病毒免疫防御反应。

关键词：罗氏沼虾 IMD信号通路 relish IMD 抗菌肽先天免疫