核酸酶诱导杂交链式反应用于信号扩增及细胞成像

作     者：龚珂珂 

作者单位：武汉大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王富安

授予年度：2020年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 

主      题：杂交链反应 脱氧核糖核酸酶 信号扩增 癌症标志物 

摘      要：杂交链式反应(HCR)是一种传统的无蛋白酶参与的核酸恒温放大策略,具有经济成本低、反应条件温和以及扩增效率高等优点,在生物分析领域引起了广泛关注。脱氧核糖核酸酶(DNAzyme)是一种经体外筛选得到的具有催化性能的单链核酸。与蛋白酶相比,DNAzyme具有功能化灵活、化学性质稳定、经济有效以及非特异性吸附低等优势。实验室常用的DNAzyme可以循环催化裂解底物,使得DNAzyme放大技术在分析检测领域的应用得到迅速发展。在本论文中,我们将HCR核酸扩增与DNAzyme信号放大技术进行整合,发展了两种无蛋白酶参与的恒温核酸扩增方法,用于癌症标志物micro RNA的检测,为早期癌症的临床诊断开辟了新的思路。具体的研究工作如下:(1)通过整合HCR核酸扩增与DNAzyme信号放大,提出了一种无蛋白酶介导的、具有多重扩增效率的反馈型HCR-DNAzyme方法,用于核酸的体外检测以及细胞内成像。基本原理是:目标分析物诱导HCR发夹交互打开自组装得到高分子量的双链核酸纳米线,此核酸共聚物中包含有两种Mg依赖的DNAzyme结构,其中一个为信号传导模块,可以催化裂解修饰有荧光团/猝灭剂的底物,获得荧光输出信号;另外一个为核酸反馈模块,剪切双链底物并释放大量的目标核酸,用于引发新一轮HCR反应。我们的信号转导模块可以进一步替换为G-四链体DNAzyme结构,进而发展出一种无需标记的比色方法,用于核酸检测。此外,通过引入辅助传感模块可以将本体系扩展为一个通用的检测方法,用于细胞内癌症标志物(如micro RNA)的检测。该扩增体系能够用于活细胞内源性miR-21致癌基因的原位扩增检测。(2)基于DNAzyme调控杂交链式反应,我们发展了一个非蛋白酶扩增体系,用于miR-21高效荧光分析。原理是:借助DNAzyme对HCR发夹反应物H(环部标记有Cy3荧光基团)进行预封闭,Zn激活DNAzyme,剪切得到带有黏性末端的发夹H,目标物miR-21引发发夹H(5’端修饰有Cy5荧光基团)和发夹H相互杂交,得到含有大量Cy3和Cy5相互靠近的双链核酸纳米线,产生FRET荧光信号,用于体外miRNA分析。该DNAzyme调控HCR反应的策略有望用于细胞内miRNA的原位监测及成像。