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杂交链反应-荧光原位杂交（HCR-FISH）技术的方法优化与应用评估研究

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杂交链反应-荧光原位杂交（HCR-FISH）技术的方法优化与应用评估...

作者：贾泽宇上海交通大学

学位级别：硕士

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）技术是环境微生物学研究中观察目标微生物的常用工具。然而,以海洋沉积物为代表的环境样品中,微生物细胞的体积、代谢活性限制了单个细胞内的核糖体RNA数量,因此,受信号强度限... 详细信息

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）技术是环境微生物学研究中观察目标微生物的常用工具。然而,以海洋沉积物为代表的环境样品中,微生物细胞的体积、代谢活性限制了单个细胞内的核糖体RNA数量,因此,受信号强度限制的传统FISH难以发挥作用。另一方面,海洋沉积物中大量的非生物颗粒的存在给FISH带来了显著的非特异性结合的问题。通常,信号强度较低的问题可以通过引入信号放大机制来改善,而非特异性信号的存在可以通过改进实验方法或使用合适的对照染色的方法予以解决。本研究中,我们尝试在沉积物样品上验证、优化引入了杂交链反应（Hybridization Chain Reaction,HCR）这一信号放大机制的FISH技术。HCR是一种在特定短链DNA的引发下,具有稳定发卡结构的两种寡核苷酸开环并相互杂交成长链DNA的过程。该长链生成的过程无需酶的参与和温度的改变。针对HCR-FISH,本研究验证了一系列降低非特异性信号的方法,尝试总结适合沉积物样品的HCR-FISH实验流程,并在中国南海等沉积物样品上验证HCR-FISH的性能。通过在代表细菌大肠杆菌（Escherichia coli）上检验已发表的HCR-FISH实验流程,发现了改进HCR-FISH效果稳定性的关键是提高杂交液中起始探针的浓度。改进后的HCR-FISH在代表细菌和古菌Methanococcoides methylutens、Thermococcus eurythermalis上均稳定呈现清晰明亮的荧光信号;测试了五种相互正交的HCR探针组,筛选出了其中两组信号稳定可靠的探针组用于之后的多色杂交。为了降低沉积物颗粒对HCR-FISH的干扰,本研究尝试了多种细胞分离的方法,挑选出了能够尽可能排除非生物颗粒、保留细胞的前处理方法;验证了三类杂交缓冲液对非特异性结合的抑制效果,确认了杂交液中EDTA的优异表现;发现DAPI在结合细胞与非生物颗粒时具有不同的荧光光谱,并据此提出了一套用于降低对照染色非特异性信号的方法;尝试了不以DNA为靶标的其他对照染色方法,拓展了对照染色的应用面。最终,提出了一套适用于海洋沉积物样品的HCR-FISH流程,并在中国南海沉积物等样品上进行验证,定量比较了HCR-FISH与传统FISH的表现差异。HCR-FISH作为一种相对简便的信号增强的荧光原位杂交技术,是研究未培养微生物为主的环境微生物学的重要方法。本研究提出了一套能够在海洋沉积物样品上稳定可靠实施的HCR-FISH流程,该流程也同样适用于海水、淡水等环境样品,为研究海洋原位微生物生理活动、相互作用提供了一套有力的工具。同时,在对照染色上的研究工作可以迁移至其他显微观察的实验流程中,辅助区分细胞与非生物颗粒。本研究提出的优化HCR-FISH流程技术方法为环境未培养微生物研究提供了有力的技术手段。

关键词：杂交链反应荧光原位杂交海洋沉积物微生物检测

基于磁性辅助的杂交链反应放大检测三磷酸腺苷

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化学通报 2018年第1期81卷 59-64,76页

作者：吕菊波张亚会刘刚徐慧鲁东大学化学与材料科学学院烟台264025

本文提出了一种基于磁性辅助的杂交链反应放大检测三磷酸腺苷(ATP)的传感策略。磁性纳米粒子表面易于修饰,而且操作方便,具有很好的分离效果,能够提高生物传感的选择性。首先,利用生物素与链霉亲和素之间的亲和力作用,将生物素标记的AT... 详细信息

本文提出了一种基于磁性辅助的杂交链反应放大检测三磷酸腺苷(ATP)的传感策略。磁性纳米粒子表面易于修饰,而且操作方便,具有很好的分离效果,能够提高生物传感的选择性。首先,利用生物素与链霉亲和素之间的亲和力作用,将生物素标记的ATP核酸适配体连接到链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子表面,加入与ATP核酸适配体互补的一段DNA进行杂交,通过磁性分离除去未杂交上的DNA,加入靶向ATP,ATP与其适配体特异性结合将适配体的互补链通过磁性分离出来,磁性分离出的信号DNA继续用于下一步的杂交链反应,将信号放大,最后利用氧化石墨烯(GO)对荧光的猝灭效应降低背景荧光,达到高灵敏度、高选择性检测靶向ATP。其中,ATP的最低检测浓度为0.1nmol/L。

关键词：氧化石墨烯杂交链反应磁性辅助荧光信号放大

基于非对称发夹探针的杂交链反应技术应用于病原菌检测的实验研究

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中华医院感染学杂志 2012年第20期22卷 4452-4455页

作者：夏涵黄君富梁盼盼黄庆府伟灵第三军医大学第一附属医院检验科重庆400038

目的应用基于非对称发夹探针的杂交链反应技术,检测肺炎克雷伯菌不对称PCR产物,建立一种新的病原菌快速检测方法。方法采用Array Designer 4.0软件,针对肺炎克雷伯菌的16SrDNA可变区域设计非对称发夹式DNA探针,优化探针浓度,以不对称PC... 详细信息

目的应用基于非对称发夹探针的杂交链反应技术,检测肺炎克雷伯菌不对称PCR产物,建立一种新的病原菌快速检测方法。方法采用Array Designer 4.0软件,针对肺炎克雷伯菌的16SrDNA可变区域设计非对称发夹式DNA探针,优化探针浓度,以不对称PCR扩增肺炎克雷伯菌16rDNA可变区所制备的单链DNA为靶序列,采用HCR进行检测和分析。结果 HCR体系中发夹探针最佳浓度为1μmol/L;当靶序列初始浓度≥0.05μmol/L时,通过琼脂糖凝胶电泳可观察到明显的HCR聚合物;不对称PCR法制备的单链DNA可以启动杂交反应。结论应用基于非对称发夹探针的杂交链反应技术检测病原菌具有反应体系简单,无需酶促反应等优点,可对血流感染病原菌基因组进行简便、快速、特异的检测。

关键词：肺炎克雷伯菌发夹DNA探针杂交链反应

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基于杂交链反应的荧光放大策略及其应用研究

基于杂交链反应的荧光放大策略及其应用研究

作者：代爽山东大学

学位级别：硕士

蛋白质类药物可分为多肽、单克隆抗体、重组疫苗和基因工程药物等。相比于传统的小分子药物而言,蛋白质类药物具有活性高、特异性强、毒性低、生物功能明确的特点。由于蛋白质类药物的体内代谢十分复杂,生物体内还存在内源性物质的干扰... 详细信息

蛋白质类药物可分为多肽、单克隆抗体、重组疫苗和基因工程药物等。相比于传统的小分子药物而言,蛋白质类药物具有活性高、特异性强、毒性低、生物功能明确的特点。由于蛋白质类药物的体内代谢十分复杂,生物体内还存在内源性物质的干扰,同时该类药物用药剂量小,体液中药物浓度极低,因此,检测方法必须具有极高的灵敏度和特异性。此外,有些蛋白质类药物除具有治疗作用之外,同时可以作为疾病诊断的标志物。能够简便、快速地从生物样品中灵敏、可靠地检测痕量的蛋白质,对疾病的早期诊断、疾病发展程度的监测、以及用药剂量的调整具有重要的意义。近年来,以核酸扩增技术为基础构建的蛋白质灵敏分析方法为其在生物样本中的定量分析提供了有力的工具和方法。其中,杂交链（hybridization chain reaction, HCR）作为一种全新的信号扩增方法受到了广泛关注。与传统的核苷酸扩增技术所不同的是,HCR是利用互补的、动力学受限的发卡结构的不断杂交而实现链的延伸,该反应中的DNA片段不是被复制,而是不断的发生自组装反应。也就是说,HCR可以在无酶的条件下实现DNA的扩增,这就为建立新型的无酶、等温扩增方法提供了思路。鉴于HCR方法的优势和应用的可行性,本课题以HCR信号扩增为基础,构建了新型荧光传感器,并用于生物样本中蛋白质的灵敏检测。本文分为三个部分：本文第一章为绪论部分,概述了蛋白质类药物检测的意义、背景、原理、检测方法以及现阶段存在的问题。并介绍了单分子分析方法在定量检测中的应用。本文第二章,利用HCR信号扩增方法和磁纳米颗粒的富集作用,构建了一种超灵敏的蛋白质荧光分析策略。在该设计中,利用磁纳米颗粒实现了抗原与扩增DNA一对多的预放大,随后,利用磁纳米颗粒上富集的大量引物链触发多个HCR反应,形成长的双螺旋DNA结构。使用SYBR Green I作为双链DNA的内插染料,实现了对蛋白质的超灵敏检测。在最佳反应条件下,对目标蛋白进行检测,线性范围为5.0×10-17mol/L到1.0×10-12mol/L,检测限为1.4×10-17mol/L。该方法特异性好,并可以对人血清样本中目标蛋白的进行定量分析。本文第三章,利用HCR信号扩增方法结合单分子检测技术构建了一种全新的蛋白质定量策略,并应用于肿瘤坏死因子-α。该方法在形成的夹心免疫复合物上结合链酶亲和素,利用链酶亲和素的多位点特点延伸出三条可以触发HCR反应的引物链,诱导发卡探针自组装形成长的双螺旋产物。以SYBR Green I作为内插染料,利用倒置落射显微镜观察基底上的亮点,以计数的方式,根据亮点个数和目标蛋白质浓度之间的关系来定量。该方法是一种可视化、数字化的定量方式,可以区分出微小浓度变化时所对应的亮点数目的变化,更适合于低浓度目标物的检测。

关键词：蛋白质类药物杂交链反应单分子检测荧光免疫传感器

基于杂交链反应的活细胞内端粒酶活性生物传感检测新方法研究

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基于杂交链反应的活细胞内端粒酶活性生物传感检测新方法研究

作者：张志乾重庆医科大学

学位级别：硕士

与人体正常组织细胞相比,肿瘤细胞的端粒酶活性增强及其导致的细胞永生化与肿瘤发生发展密切相关。然而,传统的端粒酶活性检测方法——基于聚合酶链反应的端粒重复序列扩增法(TRAP),检测过程较为复杂,并且Taq聚合酶活性容易被细胞提取... 详细信息

与人体正常组织细胞相比,肿瘤细胞的端粒酶活性增强及其导致的细胞永生化与肿瘤发生发展密切相关。然而,传统的端粒酶活性检测方法——基于聚合酶链反应的端粒重复序列扩增法(TRAP),检测过程较为复杂,并且Taq聚合酶活性容易被细胞提取物抑制。随着材料科学的发展,许多生物传感方法被用于细胞内端粒酶活性检测,但是也存在灵敏度和特异性较低的问题。针对上述存在的问题,本研究发展了一个基于杂交链反应(HCR)的细胞内端粒酶活性成像检测新方法,具体内容如下:由端粒酶引物序列(HP)、HCR启动序列(trigger)组成DNA复合体(HPT),通过脂质体转染进入细胞浆。当端粒酶存在时,HPT可以被识别并延伸,产生大量trigger从而启动HCR放大反应,最后形成一个长链带缺口的双链DNA分子,缺口处伸出的单链能与报告基团复合体中的DNA单链Q杂交,释放出带有荧光基团的F链,并产生增强的荧光信号。在细胞裂解液中,通过凝胶电泳和荧光分析证明此方法切实可行,并且优化了一系列的反应条件。在最佳反应条件下分析细胞裂解产物中的端粒酶活性,其检测限为578个细胞/100μL。用脂质体装载纳米探针转染HeLa细胞,可以在细胞内观察到明显的荧光信号,而使用ASODN特异性抑制HeLa细胞内端粒酶活性后,再检测其活性,可以看到细胞内的荧光信号明显减弱,这表明此方法能灵敏、特异检测细胞内端粒酶活性。因此,通过检测和比较不同细胞中端粒酶活性,这一方法有望成为用于以端粒酶活性升高为特征的肿瘤细胞辅助诊断方法。

关键词：端粒酶杂交链反应脂质体荧光放大肿瘤细胞

蛋白支架DNA纳米四分体介导的杂交链反应对生物标志物的高效灵敏检测

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蛋白支架DNA纳米四分体介导的杂交链反应对生物标志物的高效灵敏...

作者：林美雅湖南大学

学位级别：硕士

目前,人类对疾病威胁、环境污染及食品安全等问题的关注度日益提高,特别是人类健康问题。为了解决日益增长的社会焦点问题,分析化学成为了21世纪生命科学和纳米科技等研究领域发展的关键,这对科研工作者提出了更高要求。近年来,随着生... 详细信息

目前,人类对疾病威胁、环境污染及食品安全等问题的关注度日益提高,特别是人类健康问题。为了解决日益增长的社会焦点问题,分析化学成为了21世纪生命科学和纳米科技等研究领域发展的关键,这对科研工作者提出了更高要求。近年来,随着生物学、蛋白质组学和免疫学等交叉学科的发展,提出了一类能够影响细胞生长、改变细胞结构或功能并诱导疾病发生的有关标志物,即生物标志物。生物标志物能反应机体的病理过程,对于疾病早期诊断与预防、药物靶点确定及预后监测等方面都扮演着至关重要的角色。因此,迫切需要构建出一些简单实用、快速灵敏、放大效率高和特异性强的生物传感器。无酶参与的杂交链反应由于可在等温环境下进行简便操作,且放大效率高、特异性强,因而被广泛应用于生物传感、生物成像和生物医学领域,包括核酸与蛋白检测、活细胞成像和靶向药物输送。本论文基于蛋白支架DNA纳米四分体介导的杂交链反应,发展了新型的生物传感方法用于端粒酶及尿嘧啶-DNA糖基化酶的高效灵敏检测。本论文的具体研究内容如下:端粒酶(Telomerase)是DNA复制过程、维持染色体稳定及肿瘤生成的重要影响因素之一。高效的核酸输送平台对生物成像和基因调节具有重要意义。第2章中,我们发展了一种重组融合链霉亲和素(SA)新型蛋白支架DNA纳米四分体介导的交联杂交链反应(cHCR)用于高效核酸输送及活细胞端粒酶成像。重组SA蛋白融合了SV40 NLS和NES,并在大肠杆菌中得以表达。重组NLS-SA蛋白通过非共价作用与生物素化的四条DNA探针组装,形成结构可控的DNA四分体纳米粒子。该DNA纳米四分体由陷窝蛋白依赖的内吞途径被细胞摄取进入细胞质,具有高效的溶酶体逃逸能力,因而可增强核酸探针的输送能力。再者,该DNA纳米四分体实现了体外及胞内端粒酶响应的cHCR组装,为端粒酶的超灵敏检测与空间分辨率成像提供了有利工具,检测限为90 cells/mL。此外,活细胞成像荧光强度与端粒酶活性及其抑制剂浓度呈动态相关关系。因此,该方法有望为核酸输送和活细胞生物标志物成像提供一个高效的检测平台。尿嘧啶-DNA糖基化酶(Uracil-DNA glycosylase,UDG)是最重要的碱基切除修复酶之一,能够切除DNA链上具有遗传毒性的尿嘧啶碱基,在维持基因组完整性方面起着重要作用。目前所报道的一些UDG检测方法由于缺乏信号放大功能,限制了对低丰度UDG的快速灵敏检测。第3章中,我们构建了一种蛋白支架DNA纳米四分体介导的cHCR用于UDG活性快速灵敏检测的新方法。SA蛋白通过非共价作用与生物素化的四条DNA探针组装,形成蛋白支架的DNA四分体纳米粒子。DNA纳米四分体能够实现对UDG的高特异性响应,并形成3D交联凝胶状DNA产物,实现对UDG的高灵敏检测。此外,通过H1、H2探针共组装,构建临近杂交体系,提高DNA探针的局部浓度,从而提升cHCR反应效率,缩短反应时间。该方法对UDG的最低检测限为0.0013 U/mL,优于目前已报道的方法。因此,该方法有望为UDG的活性分析检测及其活细胞成像、相关药物制剂筛选提供一个简便、快速、灵敏的分析平台。

关键词：生物传感杂交链反应链霉亲和素-生物素系统 DNA纳米结构端粒酶尿嘧啶-DNA糖基化酶

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杂交链反应在超灵敏检测方面的应用进展

国际检验医学杂志 2019年第7期40卷 863-867页

作者：赵云虎覃晓琳杨结仪陈文韬廖仪文郑和平安徽医科大学安徽合肥230000 广东省皮肤病医院检验科广东广州510000

DNA在生命活动中具有重要意义,针对DNA检测技术日益增多,近些年一种无酶等温高效的超灵敏扩增技术,杂交链反应(HCR)逐渐引起广泛的关注。HCR,仅在特定的核苷酸引发物(NI)和两个特殊设计的发夹DNA(H1,H2)同时存在的情况下进行自组装,实... 详细信息

DNA在生命活动中具有重要意义,针对DNA检测技术日益增多,近些年一种无酶等温高效的超灵敏扩增技术,杂交链反应(HCR)逐渐引起广泛的关注。HCR,仅在特定的核苷酸引发物(NI)和两个特殊设计的发夹DNA(H1,H2)同时存在的情况下进行自组装,实现了原位扩增反应。由于NI,H1,H2的可编辑性及可修饰性,使得HCR适用于分子生物学的各个领域,具有广泛的应用前景。该文通过HCR在核酸检测、蛋白检测、细胞检测及生物成像等方面的应用进展来探究其优点和不足。

关键词：杂交链反应等温扩增超灵敏

杂交链反应催化发夹自组装用于高灵敏比色生物传感

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杂交链反应催化发夹自组装用于高灵敏比色生物传感

基于杂交链反应与酶催化银沉积的高灵敏电化学生物传感

中国化学会第十三届全国分析化学年会

作者：郭鹏张海丽俞爱民赖国松湖北师范大学化学化工学院

杂交链反应（HCR）是一种基于DNA链取代反应的等温信号放大技术,具有操作简单、不需要酶催化作用,且信号放大效率高等优点,因此近年来受到人们广泛青睐[1]。本工作设计了一种基于杂交链反应催化发夹自组装作用的高灵敏生物传感方法,并... 详细信息

杂交链反应（HCR）是一种基于DNA链取代反应的等温信号放大技术,具有操作简单、不需要酶催化作用,且信号放大效率高等优点,因此近年来受到人们广泛青睐[1]。本工作设计了一种基于杂交链反应催化发夹自组装作用的高灵敏生物传感方法,并成功将其用于凝血酶的生物识别分析。实验首先设计了7个未标记的发夹探针H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7,当识别目标物后,发夹H1打开。随后发夹H2和发夹H1杂化形成H1-H2双链DNA结构,同时释放目标物形成一个循环并再次重复打开发夹H1。此外,新形成的H1-H2双链DNA结构通过杂交链反应,依次自动与发夹H3、H4、H5杂化,形成多重支路结构,每条支路结构通过杂交链反应自动重复打开发夹H6、H7,形成大量G-四链体结构。由于G-四链体可与hemin结合形成大量DNAzyme,从而可在过氧化氢存在条件下实现基于高效酶催化显色反应的高灵敏比色信号转导[2]。由于上述杂交链反应实现了多路DNAzyme的自发形成与催化信号转导,同时,底物循环作用进一步放大了分析信号,因而该方法具有很高的分析灵敏度和很好的实用价值。

关键词：生物传感器杂交链反应 DNA酶比色分析蛋白质标记物

来源： cnki会议评论

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基于杂交链反应与酶催化银沉积的高灵敏电化学生物传感