BCAT1通过调控铁死亡影响食管鳞状细胞癌放疗耐受的研究
作者单位：南昌大学
学位级别：硕士
导师姓名：王红梅
授予年度：2023年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
摘 要：目的:放疗(radiotherapy,RT)不仅可以通过损伤DNA直接损伤肿瘤组织,还可以通过引发强烈的铁死亡造成细胞死亡。铁死亡在RT诱导的细胞死亡和肿瘤抑制中发挥重要作用,并介导RT与免疫治疗的协同作用,但辐射诱导肿瘤细胞铁死亡的调控机制目前尚不清楚。我们通过生物信息学方法筛选出食管鳞状细胞癌RT前后差异表达的基因,从中选出与铁死亡密切相关的基因支链氨基酸转氨酶1(Branched chain amino acid transaminase1,BCAT1),进而通过系列实验确定BCAT1对肿瘤细胞生物学行为、RT耐受以及肿瘤细胞铁死亡进行深入研究,本课题旨在阐明BCAT1在肿瘤RT耐受中的作用,为深入研究RT对肿瘤细胞的作用机制以及推动RT的联合治疗提供实验数据。方法:1、生物信息学分析(1)差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)的筛选:利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)(https://***/)以及基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)(https://***/geo/)和R包筛选符合要求的数据集并进行RT前后肿瘤组织DEGs分析,qPCR验证并确定候选基因。(2)BCAT1相关的生物功能分析:利用Linked Omics数据库(***/***)对TCGA-ESCA队列中筛选出的BCAT1基因相关功能进行分析,并利用GSEA富集分析对基因本体生物学过程(GOP)、细胞组成(GOC)、分子功能(GOF)以及京都基因与基因组百科(KEGG)途径进行了功能模块化的分析。(3)BCAT1与铁死亡关键基因的关系:利用GEPIA网站(http://***/)的Correlation Analysis模块分别分析BCAT1与铁死亡关键基因GPX4和SLC7A11的相关性。2、细胞实验验证差异表达基因(1)检测食管鳞状细胞癌TE-1细胞放疗前后BCAT1的变化:TE-1细胞在接受5Gy电子射线处理后,RT-qPCR以及Western Blot验证TE-1细胞处理前后BCAT1的表达情况。(2)过表达BCAT1后对TE-1细胞生物学行为的影响:将TE-1细胞通过Lipofectamine 2000转染BCAT1的c DNA质粒;RT-qPCR和Western blot分别检测转染细胞的基因和蛋白表达,运用CCK8实验检测细胞增殖能力的变化,划痕和Transwell侵袭实验验证BCAT1过表达后TE-1细胞的侵袭转移能力。RT-qPCR和Western blot检测上皮间充质转化(Epithelial mesenchymal transformation,EMT)相关指标E-Cadherin、N-Cadherin和MMP2表达情况。(3)BCAT1过表达对TE-1细胞RT耐受的影响:应用5GY的电子射线处理过表达BCAT1的TE-1细胞,免疫荧光检测TE-1细胞中DNA损伤标记物γ-H2AX的表达变化。(4)BCAT1与铁死亡之间的关系:利用铁死亡诱导剂(RSL3)处理BCAT1转染组和对照组TE-1细胞24h后,利用试剂盒检测细胞内脂质过氧化MDA、铁含量的变化以及活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)含量的变化,RT-qPCR和Western blot检测各组细胞中谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)的表达。(5)BCAT1调控RT诱导的铁死亡:RT处理BCAT1转染组和对照组TE-1细胞后,检测细胞内MDA和铁含量的变化,ROS含量检测;RT-qPCR和Western blot检测各组细胞中GPX4的表达情况。结果:1.通过对TCGA数据库食管鳞癌病人样本进行差异分析,发现在RT与未RT的食管鳞状细胞癌病人中表达上调的DEGs有272个,下调的DEGs有429个,另外通过与GEO数据库中的数据集整合分析筛选出四个共同DEGs,通过实验验证只有BCAT1在RT前后的食管鳞状细胞癌病人中具有显著差异表达,且RT后表达下调(p0.05);同时也发现BCAT1在大多数癌症当中表达是增加的。***和KEGG通路富集显示与BCAT1相关基因主要富集在巨噬细胞活化、过氧化物酶体转运、细胞外囊泡生物发生、线粒体RNA代谢过程等生物过程,以及主要参与细胞外基质相互作用途径、PI3K-AKT信号通路、癌症中的蛋白聚糖、细胞粘附分子等通路。***网站Correlation Analysis模块分析结
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