USP8稳定Cx43调控半通道活性在心肌缺血再灌注损伤中的作用及其机制研究

作     者：刘立华 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蒋丽萍

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：心肌缺血再灌注损伤 USP8 Cx43 半通道 焦亡 

摘      要：目的:心肌缺血再灌注(Ischemia reperfusion,I/R)损伤是治疗急性心肌梗死的重大挑战。连接蛋白43(Connexin 43,Cx43)构成的缝隙连接可以通过促进动作电位的快速传播,来协调心脏收缩,对心脏的发育和功能至关重要。当心肌发生I/R损伤时,缝隙连接Cx43被泛素化降解,并导致Cx43半通道活性增强。此外,异常激活的Cx43半通道又与细胞焦亡介导的炎症损伤密切相关。本研究旨在探讨泛素特异性蛋白酶8(Ubiquitin-specific peptidase 8,USP8)、Cx43及其半通道与细胞焦亡在心肌I/R损伤中的作用机制,为防治缺血性心脏病提供新的靶点及途径。方法:1.结扎大鼠左冠状动脉前降支,缺血30 min再灌注2 h,构建心肌I/R损伤模型。采用TTC染色法检测心肌梗死面积。***染色法观察心肌结构变化,ELISA试剂盒测定大鼠血清中CK-MB,c Tn I和IL-1β水平。3.组织免疫荧光法观察心肌闰盘Cx43重构现象,免疫组织化学染色法观察心肌NLRP3炎性小体表达水平。4.H9c2细胞缺氧6 h再复氧12 h,构建缺氧/复氧(Hypoxia reoxygenation,H/R)损伤模型。在显微镜下观察细胞形态学变化,Hoechst 33342/PI双染实验检测PI阳性率,LDH检测试剂盒检测LDH释放率,细胞免疫荧光实验观察NLRP3炎性小体表达水平。*** AM/Di I实验评估Cx43缝隙连接通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)功能,Et Br染料摄取实验评估Cx43半通道活性,ATP检测试剂盒检测ATP释放率。6.采用无缝克隆法构建过表达USP8质粒,并根据琼脂糖凝胶电泳和测序结果进行鉴定。*** blot检测大鼠心肌组织和H9c2细胞中USP8,NLRP3,P2X7,Cx43,GSDMD-N,ASC,cleaved-caspase-1和cleaved-IL-1β的表达水平。结果:1.大鼠I/R处理诱导严重的心肌损伤。与Sham组相比,I/R组大鼠心肌梗死面积明显增加,心肌组织结构紊乱,血清中CK-MB,c Tn I及IL-1β水平均显著升高,焦亡相关蛋白(NLRP3,GSDMD-N,ASC,cleaved-caspase-1和cleavedIL-1β)表达均上调。2.H9c2细胞H/R处理诱导细胞焦亡发生。与Control组相比,H/R组H9c2细胞质膜延伸出焦亡样大气泡,焦亡相关蛋白表达均明显上调,PI阳性率及LDH释放率显著增加。3.抑制P2X7受体缓解H/R诱导的细胞焦亡。使用10μM P2X7受体抑制剂(A-740003)预处理1 h,再H/R处理。与H/R组相比,A-740003+H/R组的NLRP3炎性小体及焦亡相关蛋白的表达显著减少,PI阳性率及LDH释放率也明显下降。***43参与心肌I/R损伤过程。与Sham组相比,I/R组心肌组织Cx43表达下调,闰盘Cx43发生偏侧化重构。与Control组相比,H/R组H9c2细胞Cx43表达下调,GJIC功能减弱,而半通道活性增强,ATP释放率显著增加。5.抑制Cx43半通道活性减轻细胞焦亡,缓解大鼠心肌I/R损伤。术前10min按12.5 mg/kg的量尾静脉注射Cx43半通道抑制剂(Gap19),再进行心肌I/R实验。与I/R组相比,Gap19+I/R组心肌梗死面积显著减少,血清中CK-MB,c Tn I及IL-1β水平明显降低,心肌组织结构得到有效改善,NLRP3炎性小体,P2X7及焦亡相关蛋白表达均下调。6.抑制Cx43半通道活性减轻P2X7/NLRP3介导的细胞焦亡。使用250μM Gap19预处理H9c2细胞30 min,再H/R处理。与H/R组相比,Gap19+H/R组Cx43半通道活性减弱,ATP释放率显著降低,P2X7及焦亡相关蛋白表达均下调,PI阳性率及LDH释放率明显下降。7.过表达Cx43抑制其半通道活性缓解P2X7/NLRP3介导的细胞焦亡。与GV-NC+H/R组相比,GV-Cx43+H/R组Cx43蛋白表达上调,半通道活性降低,ATP释放显著减少,P2X7及焦亡相关蛋白表达均下调,PI阳性率及LDH释放率明显下降。8.过表达USP8通过稳定Cx43调控其半通道活性抑制P2X7/NLRP3介导的细胞焦亡。与pc-NC+H/R组相比,pc-USP8+H/R组的USP8及Cx43蛋白表达得到有效挽救,GJIC功能改善,Cx43半通道活性降低,ATP释放明显减少,P2X7及焦亡相关蛋白表达均下调,PI阳性率及LDH释放率显著下降。结论:去泛素化酶USP8稳定Cx43调控其半通道活性,抑制P2X7/NLRP3介