在胶质瘤中TOPK磷酸化STAT3促进其转录活性

作     者：袁征 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：段秋红

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胶质瘤 磷酸化修饰 TOPK STAT3 OTS964 

摘      要：背景:胶质瘤是人颅内最常见的恶性肿瘤,近年来,虽然对胶质瘤的分子生物学特征方面有了较大进展,但在治疗方面仍未取得很大突破。寻找新的重要分子标志物对胶质瘤分子病理分型诊断、治疗及预后判断有深远的意义。本实验室前期研究发现:T细胞来源的蛋白激酶(TOPK)在胶质瘤中高表达,与胶质瘤分级呈正相关,患者的预后呈负相关;TOPK不仅促进胶质瘤细胞的生长,还直接磷酸化ULK1抑制自噬起始进而促进对替莫唑胺(TMZ)耐药。虽然关于TOPK在胶质瘤发生发展的作用有初步了解,但其详细作用机制特别是下游靶分子有待进一步深入研究。STAT3的Y705和S727的磷酸化修饰影响其在细胞内定位和转录活性,跟细胞的生长关系密切。研究发现STAT3信号通路异常激活促进胶质瘤细胞生长,但同样在胶质瘤细胞中异常活化的TOPK能否直接磷酸化修饰STAT3并调控其转录活性未见报道。目的:在胶质瘤细胞中,明确TOPK是否调控STAT3转录活性并阐明分子机制。方法:1、收集不同胶质瘤级别临床标本,用Western Blot方法检测TOPK和p STA T3(Y705和S727)的水平,分析TOPK与STAT3相关性。2、采用sh RNA沉默技术抑制胶质瘤细胞内TOPK表达,用Western Blot方法检测STAT3、p STAT3(Y705和S727)和STAT3下游效应分子BCL-2和BCL-XL。3、使用TOPK抑制剂OTS964处理细胞,用Western Blot方法检测STAT3、p STAT3(Y705和S727)。4、通过H is pull down实验、外源性和内源性Co-IP实验证明TOPK和STAT3是否存在相互作用。5、体外激酶实验和外源性IP实验证明了TOPK是否可以直接磷酸化修饰ST AT3。6、利用Net Phos 2.0网站预测STAT3潜在的磷酸化位点并体外合成相对应肽段,通过肽谱激酶实验检测TOPK磷酸化修饰STAT3的具体位点。7、采用定点突变技术构建STAT3被TOPK磷酸化修饰位点失活突变质粒(STAT3-S216A、STAT3-S521A和STAT3-S590A),与TOPK共转染至293T细胞,采用Flag抗体免疫沉淀F lag-STAT3蛋白,通过Western Blot方法检测p Ser和HA-TOPK信号。8、将空载、STAT3野生型、STAT3-S216A、STAT3-S521A和STAT3-S590A质粒以病毒包装形式感染胶质瘤细胞,建立稳定过表达细胞系,采用Western Blot方法检测BCL-2、BC L-XL的蛋白水平。9、构建STAT3-3A(S216A/S521A/S590A)和STAT3-3D(S216D/S521D/S590D)质粒,建立稳定表达细胞系,用Western Blot方法检测STAT3的靶基因BCL-2、BCL-XL的蛋白水平,采用MTT实验观察细胞增殖能力。结果:1、TOPK、pSTAT3(Y705和S727)在高级别胶质瘤临床样本中表达水平高,并且表达水平具有相关性。2、沉默TOPK或抑制TOPK活性,细胞内p STAT3(Y705和S727)水平降低,STAT3总蛋白水平下降不明显;沉默TOPK后,STAT3下游靶基因BCL-2和BCL-XL蛋白水平下调。3、His pull down实验、外源性和内源性Co-IP实验显示利用STAT3抗体免疫沉淀后的细胞裂解液可以检测到TOPK信号,同样富集TOPK后细胞裂解液可检测出STAT3信号。4、体外激酶实验中,ST AT3和TOPK同时存在的实验组、S2、S6和S7三个肽段(分别含有S216、S521和S590位点),可通过放射自显影技术检测出磷酸化信号。5、细胞外源性IP实验无EGF刺激时,转染STAT3实验组中STAT3丝氨酸磷酸化水平无明显变化;在EGF刺激后,相比于单转STAT3组,共转实验组中STAT3丝氨酸磷酸化水平升高。与转染STAT3组相比,STAT3-S216A、STAT3-S521A、STAT3-S590A三个磷酸化失活突变体组的STAT3丝氨酸磷酸化水平明显下降。6、在过表达STAT3-S216A、ST AT3-S521A和STAT3-S590A的细胞内发现BCL-2和BCL-XL蛋白水平显著下降。7、过表达STAT3-S216A/S521A/S590A细胞内的BCL-2蛋白水平无明显变化,BCL-XL蛋白水平上调。而过表达STAT3-3D质粒细胞内的BCL-XL和BCL-2蛋白水平无明显变化。MTT实验中四个过表达细胞系的细胞增殖能力之间无显著差异。结论:1、TOPK是STAT3上游蛋白激酶,磷酸化STAT3 S216、S521和S590位点。2、STAT3被TOPK磷酸化后促进其转录活性。3、STAT3 S21