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在胶质瘤中topk磷酸化STAT3促进其转录活性

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在胶质瘤中TOPK磷酸化STAT3促进其转录活性

作者：袁征华中科技大学

学位级别：硕士

背景:胶质瘤是人颅内最常见的恶性肿瘤,近年来,虽然对胶质瘤的分子生物学特征方面有了较大进展,但在治疗方面仍未取得很大突破。寻找新的重要分子标志物对胶质瘤分子病理分型诊断、治疗及预后判断有深远的意义。本实验室前期研究发现:T... 详细信息

背景:胶质瘤是人颅内最常见的恶性肿瘤,近年来,虽然对胶质瘤的分子生物学特征方面有了较大进展,但在治疗方面仍未取得很大突破。寻找新的重要分子标志物对胶质瘤分子病理分型诊断、治疗及预后判断有深远的意义。本实验室前期研究发现:T细胞来源的蛋白激酶(topk)在胶质瘤中高表达,与胶质瘤分级呈正相关,患者的预后呈负相关;topk不仅促进胶质瘤细胞的生长,还直接磷酸化ULK1抑制自噬起始进而促进对替莫唑胺(TMZ)耐药。虽然关于topk在胶质瘤发生发展的作用有初步了解,但其详细作用机制特别是下游靶分子有待进一步深入研究。STAT3的Y705和S727的磷酸化修饰影响其在细胞内定位和转录活性,跟细胞的生长关系密切。研究发现STAT3信号通路异常激活促进胶质瘤细胞生长,但同样在胶质瘤细胞中异常活化的topk能否直接磷酸化修饰STAT3并调控其转录活性未见报道。目的:在胶质瘤细胞中,明确topk是否调控STAT3转录活性并阐明分子机制。方法:1、收集不同胶质瘤级别临床标本,用Western Blot方法检测topk和p STA T3(Y705和S727)的水平,分析topk与STAT3相关性。2、采用sh RNA沉默技术抑制胶质瘤细胞内topk表达,用Western Blot方法检测STAT3、p STAT3(Y705和S727)和STAT3下游效应分子BCL-2和BCL-XL。3、使用topk抑制剂OTS964处理细胞,用Western Blot方法检测STAT3、p STAT3(Y705和S727)。4、通过H is pull down实验、外源性和内源性Co-IP实验证明topk和STAT3是否存在相互作用。5、体外激酶实验和外源性IP实验证明了topk是否可以直接磷酸化修饰ST AT3。6、利用Net Phos 2.0网站预测STAT3潜在的磷酸化位点并体外合成相对应肽段,通过肽谱激酶实验检测topk磷酸化修饰STAT3的具体位点。7、采用定点突变技术构建STAT3被topk磷酸化修饰位点失活突变质粒(STAT3-S216A、STAT3-S521A和STAT3-S590A),与topk共转染至293T细胞,采用Flag抗体免疫沉淀F lag-STAT3蛋白,通过Western Blot方法检测p Ser和HA-topk信号。8、将空载、STAT3野生型、STAT3-S216A、STAT3-S521A和STAT3-S590A质粒以病毒包装形式感染胶质瘤细胞,建立稳定过表达细胞系,采用Western Blot方法检测BCL-2、BC L-XL的蛋白水平。9、构建STAT3-3A(S216A/S521A/S590A)和STAT3-3D(S216D/S521D/S590D)质粒,建立稳定表达细胞系,用Western Blot方法检测STAT3的靶基因BCL-2、BCL-XL的蛋白水平,采用MTT实验观察细胞增殖能力。结果:1、topk、pSTAT3(Y705和S727)在高级别胶质瘤临床样本中表达水平高,并且表达水平具有相关性。2、沉默topk或抑制topk活性,细胞内p STAT3(Y705和S727)水平降低,STAT3总蛋白水平下降不明显;沉默topk后,STAT3下游靶基因BCL-2和BCL-XL蛋白水平下调。3、His pull down实验、外源性和内源性Co-IP实验显示利用STAT3抗体免疫沉淀后的细胞裂解液可以检测到topk信号,同样富集topk后细胞裂解液可检测出STAT3信号。4、体外激酶实验中,ST AT3和topk同时存在的实验组、S2、S6和S7三个肽段(分别含有S216、S521和S590位点),可通过放射自显影技术检测出磷酸化信号。5、细胞外源性IP实验无EGF刺激时,转染STAT3实验组中STAT3丝氨酸磷酸化水平无明显变化;在EGF刺激后,相比于单转STAT3组,共转实验组中STAT3丝氨酸磷酸化水平升高。与转染STAT3组相比,STAT3-S216A、STAT3-S521A、STAT3-S590A三个磷酸化失活突变体组的STAT3丝氨酸磷酸化水平明显下降。6、在过表达STAT3-S216A、ST AT3-S521A和STAT3-S590A的细胞内发现BCL-2和BCL-XL蛋白水平显著下降。7、过表达STAT3-S216A/S521A/S590A细胞内的BCL-2蛋白水平无明显变化,BCL-XL蛋白水平上调。而过表达STAT3-3D质粒细胞内的BCL-XL和BCL-2蛋白水平无明显变化。MTT实验中四个过表达细胞系的细胞增殖能力之间无显著差异。结论:1、topk是STAT3上游蛋白激酶,磷酸化STAT3 S216、S521和S590位点。2、STAT3被topk磷酸化后促进其转录活性。3、STAT3 S216、S521和S590三个位点同时磷酸化修饰后不能促进胶质瘤细胞增殖。

关键词：胶质瘤磷酸化修饰 topk STAT3 OTS964

SGK3/topk信号轴促进CKD-AVF静脉流出道新生内膜增生的作用研究

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SGK3/TOPK信号轴促进CKD-AVF静脉流出道新生内膜增生的作用研究

作者：廖倩倩华中科技大学

学位级别：硕士

目的:成熟的动静脉瘘(Arteriovenous Fistula,AVF)是终末期肾功能衰竭(End Stage Renal Disease,ESRD)血液透析(Hemodialysis,HD)患者的生命线。新生内膜增生(Neointimal Hyperplasia,NH)是动静脉瘘血管狭窄的主要原因。迄今为止,临床上缺乏有效的药物治疗NH,进一步深入探究NH的发病机制可能会引入新的治疗靶点。据文献报道,内瘘静脉平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell,VSMCs)异常增殖迁移至内膜会促进新生内膜的形成,而VSMCs的表型转化是AVF术后VSMCs增殖和迁移的关键起始性步骤。慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)会促进VSMCs的去分化,然而影响这种转变的潜在机制尚不清楚。血清糖皮质激素诱导激酶3(Serum and Glucocorticoid-inducible Kinase 3,SGK3)表达下调可导致多种细胞增殖受到抑制,例如小鼠心肌细胞、C2C12成肌细胞等。下调SGK3高度同源的亚型蛋白SGK1能够减少血管新生内膜的形成。T型淋巴因子激活的杀伤细胞来源的蛋白激酶(T-lymphokine-activated killer-cell-Originated Protein Kinase,topk)是一种在增殖活跃细胞中表达的丝-苏氨酸蛋白激酶,可促进多种肿瘤细胞增殖、迁移。组蛋白3(Histone3,H3)是topk的下游靶标之一可被其磷酸化。磷酸化H3(Phospho-Histone3,p H3)是细胞有丝分裂的标志物。因此SGK3、topk可能通过调节VSMCs的的有丝分裂从而促进VSMCs增殖、迁移。但SGK3是否参与调节VSMCs中topk的表达及功能以及SGK3、topk对动静脉瘘静脉流出道NH的影响尚未可知。本研究拟探讨SGK3调控topk的具体机制及其在CKD-AVF血管狭窄中的作用。方法:1.将8周龄雄性C57BL/6小鼠分为:假手术+AVF组;CKD+AVF组;假手术+AVF+HI-topk-032注射6周组;CKD+AVF+HI-topk-032注射6周组(在AVF术前2周及术后4周每周给小鼠间断腹腔注射HI-topk-032四次);假手术+AVF+HI-topk-032注射4周组;CKD+AVF+HI-topk-032注射4周组(在AVF术后4周每周给小鼠间断腹腔注射HI-topk-032四次)。HI-topk-032注射4周组是从AVF手术同周开始注射HI-topk-032,由于大部分小鼠的AVF需要在手术后4周左右成熟,故选择4周这个时间节点,作为治疗组观察给药的效果。6周组是在AVF术前2W给药持续到术后4周,目的是想探究这种预防性给药的效果是否更优于术后的治疗组。采用左侧5/6肾脏切除术构建CKD小鼠模型,从小鼠眶静脉中取血标本检测血肌酐及尿素氮。右侧颈总动脉及颈外静脉端端吻合构建AVF小鼠模型,并分别于AVF术前2周及术后4周腹腔注射HI-topk-032(10mg/kg),AVF术后4周取小鼠AVF静脉流出道行伊红(Hematoxylin-eosin Staining,HE)、免疫荧光(Immunity Fluorescence,IF)、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色检测SGK3、topk、增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antige,PCNA)、平滑肌肌动蛋白α(Alpha Smooth Muscle Actin,α-SMA)表达。2.临床上收集10例拟行冠脉搭桥术患者的健康大隐静脉,排除大隐静脉曲张的患者,作为对照组。另外收集10例ESRD且需要维持性血液透析,已行AVF手术并出现AVF失功患者的AVF静脉流出道血管组织作为实验组,排除血管条件差、糖尿病、动脉粥样硬化或合并其他严重疾病的患者。将收集到的人体AVF及其静脉流出道的血管组织进行SGK3、topk的IHC染色。3.采用20%的CKD 5期非透析患者的血清体外培养人VSMCs 48h。运用SGK3抑制剂SGK3-PROTAC1、SGK3激活型质粒SGK3-S486D、topk抑制剂OTS964、topk激活型质粒T9E、血小板衍生生长因子-BB(Platelet Derived Growth Factor-BB,PDGF-BB)分别处理培养小鼠VSMCs,通过免疫印迹、实时定量PCR、细胞活性检测(Cell Counting Kit-8,CCK8)、伤口划痕实验检测SGK3、topk、p-topk、PCNA、p H3、血管细胞黏附分子1(Vascular Cell Adhesion Molecule 1,VCAM-1)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor Alph

关键词：慢性肾脏病新生内膜增生动静脉瘘血管狭窄 topk SGK3

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间变性大细胞淋巴瘤的临床病理和遗传学研究

间变性大细胞淋巴瘤的临床病理和遗传学研究

作者：黄晓红桂林医学院

学位级别：硕士

目的:间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)是一类异质性的T细胞淋巴瘤,目前研究发现,其不同的分子亚型具有不同的临床预后和遗传学特点。本研究总结系统性ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤(ALK+ALCL)、系统性ALK阴性间变性大细胞淋巴瘤(ALK-ALCL)和原发... 详细信息

目的:间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)是一类异质性的T细胞淋巴瘤,目前研究发现,其不同的分子亚型具有不同的临床预后和遗传学特点。本研究总结系统性ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤(ALK+ALCL)、系统性ALK阴性间变性大细胞淋巴瘤(ALK-ALCL)和原发皮肤间变性大细胞淋巴瘤(PC-ALCL)的临床、病理和遗传学特征,对比这三个亚型的临床和病理学特征、免疫表型、分子遗传学和预后的差别,探讨p63、topk蛋白在ALCL中表达的临床病理学意义、DUSP22和TP63基因重排的情况,筛选ALCL诊断、分型以及预后评估的标志物,为临床诊疗提供依据。方法:1.选取2010年1月至2020年6月25例ALCL石蜡组织标本,收集、回顾性分析患者的临床病理及随访资料。应用免疫组织化学法检测肿瘤细胞中T细胞抗原、细胞毒标志、EMA、MUM-1、CD56、p53、p63以及topk蛋白的表达;采用荧光原位杂交技术(FISH)检测ALK-ALCL和PC-ALCL病例中DUSP22和TP63基因状态;用统计学方法分析比较ALCL各分子亚型之间临床和病理学的差异及预后。2.选取2019年至2021年30例T细胞淋巴瘤石蜡组织标本,包括15例NK/T细胞淋巴瘤(NKTCL)、9例血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)和6例T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤(T-ALL/LBL)。应用免疫组织化学法检测topk蛋白的表达;用统计学方法分析比较topk在ALCL和其它T细胞淋巴瘤中的表达差异。结果:1、临床特征:本组共25例ALCL病例,包括15例ALK+ALCL、6例ALK-ALCL和4例PC-ALCL。在ALK+ALCL病例中,男女比例为3:2,中位年龄为29岁,其中9例(60%)原发于淋巴结内,6例(40%)原发于淋巴结外;在ALK-ALCL病例中,男女比例为5:1,中位年龄为43.5岁,其中2例(33%)原发于淋巴结内,4例(67%)原发于淋巴结外;在PC-ALCL病例中,男女比例为1:1,中位年龄为61岁。本组研究中,三种亚型的ALCL的临床特点经统计学分析,均无明显差异。2、形态学特征:在25例ALCL中,23例(92%)为经典型;在ALK+ALCL中,有2例为小细胞型;PC-ALCL病例的肿瘤细胞均未突破表皮,表现为真皮内浸润性生长,表皮有激惹现象,呈假上皮瘤样增生,易误诊为鳞状细胞癌。3、免疫表型:经统计分析,ALK+ALCL较ALK-ALCL更易丢失CD2(P0.05)。对p63阳性的ALK-ALCL和PC-ALCL病例进行TP63基因FISH检测,只有1例(1/5)检测到TP63基因分离。对所有ALK-ALCL和PC-ALCL病例进行DUSP22基因FISH检测,发现:(1)1例TP63基因分离的病例,同时存在DUSP22基因分离;(2)在p63表达阳性、TP63基因分离阴性的其它4个病例中,检出1例DUSP22基因分离的病例;(3)检出1例DUSP22基因分离的病例,p63表达阴性;(4)3例检测出DUSP22基因为多拷贝数,其中1例p63表达阳性。5、预后分析:利用SPSS 22.0软件分析比较ALK+ALCL、ALK-ALCL和PC-ALCL的预后,结果显示本组三种ALCL亚型的预后无显著差异(P=0.135);分析比较年龄topk在ALCL、NKTCL、AITL和T-ALL/LBL中的表达:25例ALCL、15例NKTCL、9例AITL和6例T-ALL/LBL均进行topk蛋白免疫组化染色,topk在NKTCL、AITL和T-ALL/LBL中的表达率分别为47%(7/15)、44%(4/9)和0%(0/6),在ALCL中的表达率为100%(23/23),经统计分析,topk在ALCL中的表达高于NKTCL、AITL和T-ALL/LBL(P=0.000)。结论:1、在ALK-ALCL和PC-ALCL中,p63表达阳性,TP63基因不一定会分离,p63蛋白检测在临床上可用来筛选病例进行FISH基因检测。2、对于ALK表达阴性的ALCL病例,如果p63表达阳性,建议同时检测DUSP22和TP63基因重排状态;如果p63表达阴性,则建议检测DUSP22基因重排状态,有利于全面

关键词：间变性大细胞淋巴瘤 p63 DUSP22 TP63 topk

三阴乳腺癌新辅助化疗的预后与Ki-67、topk的表达情况相关性研究

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现代生物医学进展 2022年第8期22卷 1514-1518页

作者：徐帅张振张喜平白雪峰白海珍内蒙古自治区人民医院急诊医学科内蒙古呼和浩特010017 内蒙古医科大学附属医院甲乳外科内蒙古呼和浩特010020 内蒙古自治区人民医院甲乳疝外科内蒙古呼和浩特010017

目的:研究三阴乳腺癌(TNBC)新辅助化疗(NACT)的预后与Ki-67、topk的表达情况的相关性。方法:回顾性收集2014年3月至2016年6月期间我院收治并行NACT的TNBC患者90例作为研究对象,免疫组化法检测肿瘤组织中Ki-67和topk的表达,分析两者的表... 详细信息

目的:研究三阴乳腺癌(TNBC)新辅助化疗(NACT)的预后与Ki-67、topk的表达情况的相关性。方法:回顾性收集2014年3月至2016年6月期间我院收治并行NACT的TNBC患者90例作为研究对象,免疫组化法检测肿瘤组织中Ki-67和topk的表达,分析两者的表达与患者临床资料的关系,应用COX回归模型进行生存分析,分析影响TNBC患者预后的独立危险因素。结果:在治疗情况方面,91.11%(82/90)的患者接受了≥4个周期的NACT治疗,84.44%(76/90)的患者接受了手术治疗,术后p CR为22.22%(20/90),ORR为75.56%(68/90)。为期5年的随访中,90例患者中共死亡8例(死于TNBC者6例,其他原因2例),失访2例;治疗后Ki-67和topk的阳性率均显著低于治疗前(Ptopk阳性和阴性表达病例在不同TNM分期、淋巴结是否转移上具有显著性差异(Ptopk阳性表达患者的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)显著短于阴性表达者(Ptopk阳性表达均为影响TNBC患者预后的独立危险因素。结论:Ki-67和topk在TNBC组织中的表达与患者的病理学特征及预后密切相关,是影响预后的独立危险因素。

关键词：三阴乳腺癌新辅助化疗 Ki-67 topk

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移动对象环境下的topk差值聚合查询策略

计算机研究与发展 2006年第Z3期43卷 102-107页

作者：关晶王斌李柰罗旭王国仁信俊昌东北大学信息科学与工程学院沈阳110004 东北大学信息科学与工程学院沈阳110004 东北大学信息科学与工程学院沈阳110004 沈阳师范大学计算机中心沈阳110004 东北大学信息科学与工程学院沈阳110004 东北大学信息科学与工程学院沈阳110004

聚合查询(GNN)在空间数据库以及网络环境中是一个相对比较新的操作.与传统的只有一个查询结点的kNN查询相比,GNN具有多个查询结点,由于查询点的数目以及它们在数据库空间中分布的任意性,使得GNN查询比只有一个查询点的kNN查询复杂得多.... 详细信息

聚合查询(GNN)在空间数据库以及网络环境中是一个相对比较新的操作.与传统的只有一个查询结点的kNN查询相比,GNN具有多个查询结点,由于查询点的数目以及它们在数据库空间中分布的任意性,使得GNN查询比只有一个查询点的kNN查询复杂得多.提出了一种基于2个查询点的差值聚合查询,在GNN查询方法中提出的将多个查询点分布于一个MBR的算法并不适用于此类差值查询.基于单查询点的YPK-CNN,利用双曲线性质把查询空间分成几大部分,在此基础上计算出双曲线的渐近线以简化删减条件,直接删减掉不符合条件的搜索空间.实验结果显示,针对这种特定的差值聚合查询,所提出的基于双曲线渐近线过滤策略的查询算法要比基本查询算法在查询响应时间和访问结点次数方面更高效.

关键词： topk 最近邻居查询聚合查询 GRID索引结构

topk激酶促进RAS突变肺癌转移的机制研究

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TOPK激酶促进RAS突变肺癌转移的机制研究

作者：姚硕华中科技大学

学位级别：硕士

目的:肿瘤侵袭和转移是复杂的生物学过程,上皮间质转化(EMT)是参与调控的关键环节,与癌基因异常激活密切相关。RAS突变是人类肿瘤中最常见的癌基因。根据前期的研究和相关报道,我们发现在RAS突变的肺癌细胞中,RAS异常激活与EMT密切相关... 详细信息

目的:肿瘤侵袭和转移是复杂的生物学过程,上皮间质转化(EMT)是参与调控的关键环节,与癌基因异常激活密切相关。RAS突变是人类肿瘤中最常见的癌基因。根据前期的研究和相关报道,我们发现在RAS突变的肺癌细胞中,RAS异常激活与EMT密切相关,但具体机制不明。本课题对其分子机制进行进一步研究,意在发现RAS调控转移的分子机子,为RAS突变的肺癌提供新的治疗靶点。方法:(1)用4-OHT异常激活RAS突变转化细胞系MCF10AER:HRAS V12和HKe3ER:HRAS V12后用WB、Trans-well invasion实验、划痕实验检测细胞EMT表型的变化情况。(2)在K-RAS突变的非小细胞肺癌细胞株A549和H157细胞中敲除K-RAS,用WB、Trans-well、划痕实验检测其EMT的变化情况。(3)通过Protein Kinase Array分析,寻找RAS被异常激活之后,哪些激酶分子的活性发生变化,以寻找可能的下游分子。(4)通过不同的激酶抑制剂筛选RAS介导的EMT中发挥了关键作用的蛋白激酶。(5)通过数据库分析RAS下游激酶分子topk对于非小细胞肺癌患者的肿瘤分级、复发、预后均有影响,以及寻找topk作用的底物分子。(6)Pull-down实验和免疫共沉淀实验检测topk和自噬适配蛋白P62蛋白的相互作用。(7)原核表达、纯化P62蛋白,与活化的topk进行激酶实验,检测是否存在磷酸化的关系。(8)用Netphos2.0预测P62可能被磷酸化的位点,合成相应肽段,与活化的topk进行激酶实验,检测其具体的磷酸化位点。结果:(1)RAS异常激活可以促进细胞EMT的发生,在K-RAS突变的非小细胞肺癌细胞中敲低K-RAS可以逆转EMT。(2)RAS异常激活后除了常见的ERK、MEK、AKT,MAPK的活性变化明显外,topk蛋白的活性也明显增强。(3)topk的表达水平对于非小细胞肺癌患者的分级、复发及预后均有影响。(4)topk在肺腺癌患者的蛋白表达与自噬适配蛋白P62的蛋白表达呈正相关,RAS激活后topk和P62表达增高。(5)topk可以与P62相互结合并且在S24位点磷酸化P62。结论:在RAS异常激活的非小细胞肺癌中,topk的活性增高,抑制topk可以逆转肿瘤细胞的EMT,并且topk可以于S24位点磷酸化自噬相关分子P62。topk磷酸化P62有可能参与调控RAS介导的EMT。

关键词：非小细胞肺癌 RAS突变 EMT topk P62 磷酸化

topk和TLR2在恶性淋巴瘤组织中的表达及意义

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TOPK和TLR2在恶性淋巴瘤组织中的表达及意义

作者：谭美英南华大学

学位级别：硕士

目的：检测topk与TLR2蛋白在恶性淋巴瘤及淋巴结反应性增生临床标本中的表达，探讨topk和TLR2在EBV相关淋巴瘤发生中的意义。材料与方法：利用三种淋巴瘤组织芯片检测topk、TLR2蛋白的表达和EBV的感染，合计171例。收集淋巴瘤组织蜡块11... 详细信息

目的：检测topk与TLR2蛋白在恶性淋巴瘤及淋巴结反应性增生临床标本中的表达，探讨topk和TLR2在EBV相关淋巴瘤发生中的意义。材料与方法：利用三种淋巴瘤组织芯片检测topk、TLR2蛋白的表达和EBV的感染，合计171例。收集淋巴瘤组织蜡块113例和淋巴结反应性增生组织蜡块44例，采用免疫组织化学染色方法（SP法）检测topk和TLR2蛋白在淋巴瘤及淋巴结反应性增生组织中的表达;采用原位分子杂交检测淋巴瘤组织中EBER的表达。分析topk和TLR2的表达与EBV感染及淋巴瘤临床病理参数的关系。结果：1．topk蛋白在淋巴瘤及淋巴结反应性增生组织中的表达1.1淋巴瘤组织芯片中topk的表达及与临床病理特征的关系topk蛋白阳性着色定位于细胞质或/和细胞核中。在90例淋巴瘤组织芯片中topk蛋白的阳性表达率为64.4%（58/90），其中霍奇金、非霍奇金、B细胞、T细胞性淋巴瘤的阳性表达率分别为50.0%（5/10）、66.3%（53/80）、69.4%（50/72）和37.5%（3/8）;霍奇金与非霍奇金淋巴瘤、 B细胞与T细胞性淋巴瘤相比，差异均无显著性意义（p＞0.05）。topk蛋白阳性表达与患者性别、年龄、部位无相关性(p＞0.05)。1.2淋巴瘤及淋巴结反应性增生组织石蜡标本中topk的表达及与临床病理特征的关系在113例淋巴瘤组织石蜡标本中topk蛋白的阳性表达率为38.1%（43/113），其中B细胞、T细胞和霍奇金淋巴瘤中topk蛋白的阳性表达率分别为40.0%（24/60）、42.2%（19/45）、0%（0/8），topk蛋白在反应性增生淋巴结组织石蜡标本中的阳性表达率为18.2%（8/44）。topk蛋白在淋巴瘤和反应性增生淋巴结组织中的表达，差异有显著性意义(p＜0.05)。B细胞与T细胞性淋巴瘤比较，topk蛋白表达的差异无显著性意义(p＞0.05)。topk蛋白阳性表达与患者性别、年龄、部位无相关性(p＞0.05)。2．TLR2蛋白在淋巴瘤及淋巴结反应性增生组织中的表达2.1淋巴瘤组织芯片中TLR2蛋白的表达TLR2蛋白在38例非霍奇金淋巴瘤组织芯片中的表达均呈阴性。2.2淋巴瘤及淋巴结反应性增生组织石蜡标本中TLR2蛋白的表达及与临床病理特征的关系TLR2阳性着色定位于细胞膜或/和细胞质。在111例淋巴瘤组织中TLR2蛋白的阳性表达率为12.6%(14/111)，其中B细胞、T细胞、霍奇金淋巴瘤中TLR2蛋白的阳性表达率分别为0%（0/60）、30.2%（13/43）和12.5%（1/8），TLR2蛋白在淋巴结反应性增生组织中的阳性表达率为27.5%（11/40）。TLR2蛋白在淋巴瘤和反应性增生淋巴结组织中的表达，差异有显著性意义(p＜0.05)。霍奇金与非霍奇金淋巴瘤比较，TLR2蛋白表达的差异无显著性意义(p＞0.05)。TLR2蛋白在60例B细胞性淋巴瘤中的表达均呈阴性。TLR2蛋白阳性表达与患者性别、年龄、部位无相关性(p＞0.05)。3．EBER在淋巴瘤组织中的表达3.1淋巴瘤组织芯片中EBER的表达及与临床病理特征的关系EBER阳性着色定位于细胞核。在43例非霍奇金淋巴瘤组织芯片中EBER阳性表达率为48.8%（21/43），其中B细胞和T细胞性淋巴瘤的阳性表达率分别为47.4%（18/38），60.0%（3/5）。B细胞与T细胞性淋巴瘤相比，差异无显著性意义（p＞0.05）。淋巴瘤组织芯片中的EBER阳性表达与患者性别、年龄、部位无相关性(p＞0.05)。3.2淋巴瘤石蜡组织标本中EBER的表达及与临床病理特征的关系在111例淋巴瘤石蜡标本中EBER的阳性表达率为33.3%（37/111），其中霍奇金、非霍奇金、T细胞与B细胞淋巴瘤组织中的EBER阳性表达率分别为50%（4/8）、32.0%（33/103）、55.8%（24/43）、15.0%（9/60）。霍奇金与非霍奇金淋巴瘤组织中的EBER阳性表达率的差异无显著性意义(p＞0.05)。EBER在T细胞与B细胞性淋巴瘤组织中的阳性表达率的差异有显著性意义(p＜0.01)。EBER阳性表达与患者性别、年龄、部位无相关性(p＞0.05)。结论：1、topk蛋白在淋巴瘤组织中表达上调。2、TLR2蛋白在淋巴瘤组织中表达下调。

关键词：淋巴瘤 topk TLR2 EBER

topk参与CXCL8诱导结直肠癌细胞抵抗失巢凋亡的分子机制及临床意义研究

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TOPK参与CXCL8诱导结直肠癌细胞抵抗失巢凋亡的分子机制及临床意...

作者：肖尤川昆明医科大学

学位级别：硕士

[研究背景和目的] 肿瘤细胞脱离原发灶或转移灶进入血液系统形成循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)。CTCs的发现迄今已有一百多年的历史,并且一直被看作是肿瘤复发和转移的根源。进入血液循环的大多数肿瘤细胞都发生了失巢凋... 详细信息

[研究背景和目的] 肿瘤细胞脱离原发灶或转移灶进入血液系统形成循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)。CTCs的发现迄今已有一百多年的历史,并且一直被看作是肿瘤复发和转移的根源。进入血液循环的大多数肿瘤细胞都发生了失巢凋亡,只有少部分得以存活下来。面对极其复杂的机体环境,CTCs是通过何种方式生存下来,又是何种原因促进其获得了凋亡抵抗能力尚不完全清楚。近年来研究显示,白介素-8(interleukin-8, IL-8),又称CXCL8,不仅能够促进肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移及肿瘤血管生成,还能激活细胞内多条生存通路,抑制细胞内凋亡信号。本研究旨在探讨CXCL8与结直肠癌细胞失巢凋亡的关系,分析CXCL8促进结直肠癌细胞抵抗失巢凋亡的分子机制,寻找并试图阻断CXCL8介导的促细胞生存信号的关键靶点,同时检测结直肠癌组织中CXCL8及其下游靶蛋白的表达情况,评价其临床意义,为建立降低结直肠癌复发、转移的新策略提供新的思路。 [研究方法] 1.CXCL8促进肠癌细胞抵抗失巢凋亡的体外研究 (1)失巢凋亡模型构建：应用聚羟乙基异丁烯酸(Poly-HEMA)包被培养板阻止细胞贴壁,将肠癌细胞悬浮培养,模拟肠癌细胞的失巢状态。 (2)CXCL8的表达与肠癌失巢凋亡敏感性的研究：应用免疫荧光技术、RT-PCR和Western blot检测多种肠癌细胞系内CXCL8的表达水平。应用FITC-AnnexinV/PI双染法分选凋亡细胞,流式细胞术检测不同时间点贴壁和失巢肠癌细胞的凋亡改变,分析CXCL8与肠癌细胞失巢凋亡敏感性的相关性。 (3)CXCL8对肠癌细胞失巢凋亡的影响：以不同浓度的CXCL8分别作用于肠癌细胞系SW480、Caco2,72h后应用AnnexinV-FITC染色试剂盒及流式细胞仪检测肠癌细胞凋亡率的变化,应用噻唑蓝(MTS)实验检测CXCL8作用后失巢和贴壁肠癌细胞的增殖率,应用Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白caspase-3和Bc12的表达,初步探讨CXCL8诱导失巢凋亡的机制。再次应用最佳浓度的CXCL8作用于肠癌细胞Lovo、HT29和HCT116,于48h后再次检测细胞凋亡改变,确定CXCL8对肠癌细胞失巢凋亡抵抗的诱导效应。 2.CXCL8诱导肠癌细胞失巢凋亡抵抗分子机制的研究 (1)Western blot检测CXCL8作用组和空白组肠癌细胞SW480和Caco2内T-AKT、P-AKT、T-ERK、P-ERK、topk表达的改变。 (2)抑制试验：在加入CXCL8前预先用AKT抑制剂MK2206和ERK1/2抑制剂U0126处理肠癌细胞,应用流式细胞仪FITC-AnnexinV/PI双染法检测肠癌细胞凋亡率,应用Western blot检测细胞内T-AKT、P-AKT、T-ERK、P-ERK和topk表达的改变。 (3)干扰试验：在CXCL8作用前,分别应用AKT siRNA、topk siRNA、 ERK siRNA敲除细胞内AKT、topk和ERK基因,应用Western blot检测相关信号蛋白表达的改变,应用流式细胞仪FITC-AnnexinV/PI双染法检测肠癌细胞凋亡率。 3.CXCL8和topk在结直肠癌组织中表达的临床意义研究 (1)免疫组织化学检测肠癌组织及其配对的正常组织内的CXCL8和topk的表达。 (2)分析CXCL8与topk表达的相关性及二者表达与肠癌临床病理的相关性。 (3)CXCL8与topk表达和肠癌患者生存的相关性。 [研究结果] 1、CXCL8促进肠癌细胞抵抗失巢凋亡的体外实验 (1)在肠癌细胞系内源性CXCL8表达水平与其失巢凋亡敏感性呈负相关,与其贴壁细胞生长凋亡无关。 (2)外源性CXCL8能够促进肠癌细胞系抵抗失巢凋亡。 (3)CXCL8激活了细胞内PI3K/AKT和ERK1/2信号通路,上调了Bcl2的表达,促进肠癌细胞抵抗失巢凋亡。 (4)topk是PI3K/AKT与ERK之间的对话参与肠癌细胞的失巢凋亡抵抗。 2、肠癌组织表达CXCL8和topk的临床研究结果 (1)CXCL8和topk在肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(x2=53.281,P=0.000;x2=372.000,P=0.000)。 (2)在肠癌组织中,CXCL8和topk的表达呈正相关(r=0.254,P=0.000)。 (3)在肠癌组织中,CXCL8表达与肠癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肝转移相关(Ptopk表达与肠癌发生部位、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肝转移、血清CEA水平相关(Ptopk高表达的CRC患者无瘤生存期和总生存期都短于低表达患者,统计学具有显著差异(总生存期：log rank=11.302, P=0.001;lo

关键词：结直肠癌细胞 CXCL8 失巢凋亡抵抗 PI3K/AKT ERK1/2 topk

topk在Apoptin诱导肿瘤凋亡效应中的作用研究

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TOPK在Apoptin诱导肿瘤凋亡效应中的作用研究

作者：刘妮妮华中科技大学

学位级别：硕士

目的:探讨肿瘤细胞中topk对Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡效应的影响;明确topk对Apoptin的磷酸化作用,并初步判断其磷酸化位点。方法:1.采用质粒大提的方法,制备慢病毒包装所需质粒、pcDNA3.1、pcDNA3.1-HA-topk真核表达质粒;采用原核细胞诱... 详细信息

目的:探讨肿瘤细胞中topk对Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡效应的影响;明确topk对Apoptin的磷酸化作用,并初步判断其磷酸化位点。方法:1.采用质粒大提的方法,制备慢病毒包装所需质粒、pcDNA3.1、pcDNA3.1-HA-topk真核表达质粒;采用原核细胞诱导表达的方法,制备纯化的PTD4-apoptin(简称P4A)蛋白。2.培养多种人肿瘤细胞,Western Blot检测topk表达水平,选择topk表达水平不同的HCT116、SGC7901和HepG2细胞进行后续实验。将P4A蛋白与上述细胞孵育,采用下列方法检测肿瘤细胞对P4A的敏感性:MTT检测P4A蛋白对细胞增殖活性的影响;Western Blot检测凋亡相关蛋白c-caspase3的表达。3.在topk高表达的HCT116、SGC7901细胞中,采用慢病毒介导的sh RNA沉默技术,建立topk沉默细胞系。Western Blot检测topk表达水平鉴定沉默效果。将P4A蛋白与上述细胞孵育,通过与sh Mock组对比,研究沉默topk表达对P4A蛋白诱导HCT116、SGC7901细胞凋亡的影响。4.在topk低表达的HepG2细胞,通过脂质体转染的方法实现topk过表达。Western Blot检测topk表达水平鉴定转染效果。将P4A蛋白与上述细胞孵育,检测过表达topk对P4A蛋白诱导HepG2细胞凋亡的影响。5.采用活化的topk为激酶、纯化的P4A蛋白为底物,开展体外激酶实验,研究topk对Apoptin蛋白的磷酸化作用。利用Net Phos2.0软件分析Apoptin序列中Ser、Thr位点,筛选出分值较高者的位点,合成肽段。采用活化的topk和肽段,开展体外激酶实验,研究topk对不同肽段的磷酸化作用,初步确定Apoptin序列上topk的磷酸化修饰位点。结果:1.将慢病毒包装所需质粒转染到293T细胞中,成功获得慢病毒。提取pcDNA3.1、pc NDA3.1-HA-topk真核表达质粒;采用原核细胞诱导表达的方法,制备纯化的PTD4-apoptin(简称P4A)蛋白。2.Western Blot检测,topk在HCT116、SGC7901细胞呈高表达;在Hela细胞中呈中等程度表达;在MKN45、HepG2细胞中呈低表达。孵育P4A蛋白后,HCT116、SGC7901、HepG2细胞的增殖活性较未处理组相比显著下降,凋亡相关蛋白c-caspase3的表达水平也显著升高。说明P4A蛋白诱导上述细胞发生凋亡。3.Western Blot结果表明,在结肠癌细胞HCT116以及胃癌细胞SGC7901中topk基因沉默细胞系建立成功。孵育P4A蛋白后,MTT结果显示sh topk组细胞增殖活性要明显高于sh Mock组;两种细胞的sh topk组的c-caspase3的表达水平较sh Mock组相比都有明显的降低。说明沉默topk的表达,P4A蛋白对SGC7901、HCT116细胞的凋亡诱导效应降低。4.在topk低表达的HepG2细胞中,转染pcDNA3.1-HA-topk质粒,topk的表达水平明显升高,表明转染成功。与未孵育P4A蛋白组相比,孵育P4A蛋白组细胞的增殖活性显著降低,而其c-caspase3的表达水平显著升高,说明P4A蛋白能够诱导HepG2细胞发生凋亡。但是转染topk表达组细胞在孵育P4A蛋白后,细胞增殖抑制率以及c-caspase3的表达水平要明显高于单独孵育P4A蛋白组。说明上调topk的表达,P4A蛋白对HepG2细胞的凋亡诱导效应升高。5.体外激酶实验证明topk可以直接磷酸化P4A蛋白,可能磷酸化的位点有Ser89、Ser93、Thr8、Thr20、Thr27、Thr56、Thr108、Thr114。结论:在topk高表达的HCT116、SGC7901细胞中,沉默topk的表达,P4A蛋白的凋亡诱导效应降低;在topk低表达的HepG2细胞中,上调topk的表达,P4A蛋白的凋亡诱导效应升高。体外激酶实验证明:活化的topk可以直接磷酸化P4A,可能磷酸化的位点有Ser89、Ser93、Thr8、Thr20、Thr27、Thr56、Thr108、Thr114。

关键词： topk Apoptin 肿瘤凋亡磷酸化