LIN9在肺鳞状细胞癌中的临床病理意义及潜在机理研究

作     者：王向明 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李祖云

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：LIN9 肺鳞状细胞癌 免疫组织化学 细胞周期 基因敲低 

摘      要：研究背景肺癌(Lung Cancer,LC)是目前国际范围内致死性最高的恶性肿瘤。肺鳞状细胞癌(Lung Squamous Cell Carcinoma,LUSC)是LC常见的组织学亚型之一,主要起源于气管与支气管的鳞状化生上皮。近十年来,接受放、化疗的LUSC患者,其五年生存率均尚不足15%,治疗状况仍不理想。因此,开发新兴的治疗手段,对提高LUSC患者的生存率,无疑是一项亟待发展的举措。LIN9作为DREAM Muv B核心复合物的一个基因组分,目前在乳腺癌、卵巢癌及肝细胞癌中已有文献报导。然而,LIN9在LUSC中的临床病理意义及潜在机理,迄今为止尚未有过报道。研究目的(1)探究LIN9蛋白在LUSC组织中的表达情况,及LIN9蛋白在LUSC细胞中的分布位置;(2)探索LIN9蛋白的表达水平与LUSC患者临床病理参数及预后的关系;(3)探讨LIN9对人类LUSC NCI-H226细胞株增殖、侵袭、迁移、凋亡、细胞周期等细胞恶性生物学行为的影响;(4)初步探究LIN9在LUSC的致癌过程中潜在的分子机制。材料与方法1.基于LUSC组织芯片进行免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)实验,针对其中由52例LUSC组织以及57例癌旁/正常肺组织组成的样本,测定每个样本中LIN9蛋白的染色分数,并通过显微光镜下观察,确定LIN9蛋白在LUSC细胞中的主要分布区域。2.基于LUSC组织芯片中LUSC患者的临床资料,运用卡方检验的统计学方法,分析LIN9蛋白的表达水平与LUSC患者的临床病理参数之间的相关性;运用单因素cox回归分析的统计学方法,分析导致LUSC患者预后不良的潜在危险因素。3.对人类LUSC NCI-H226细胞株进行培养,将其分为5组:空白对照组(control check,CK)、LIN9过表达(LIN9-OE)、LIN9过表达阴性对照组(LIN9-OE NC)、LIN9敲低(si-LIN9)、LIN9敲低阴性对照组(si-LIN9NC),分别进行以下细胞实验,探究LIN9对NCI-H226细胞株功能的影响:(1)通过荧光RT-q PCR实验,分别检测NCI-H226细胞中LIN9、CCNB1m RNA的表达水平;(2)通过Western blotting(WB)实验,分别检测NCI-H226细胞中LIN9、CCNB1蛋白的表达水平;(3)通过CCK-8实验,检测NCI-H226细胞的增殖能力;(4)通过transwell实验,检测NCI-H226细胞的侵袭能力;(5)通过细胞划痕实验,检测NCI-H226细胞的转移能力;(6)通过TUNEL实验,检测NCI-H226细胞的凋亡能力;(7)通过流式细胞术,检测在各细胞周期的NCI-H226细胞所占的比例。4.检索The Cancer Genome Atlas(TCGA)、Genotype-Tissue Expression(GTEx)、Gene Expression Omnibus(GEO)、Sequence Read Archive(SRA)、Array Express、Oncomine等公共数据库,并通过中、英文文献库进行文献调研,以搜集并纳入与人类LUSC相关的公共数据集,并对LIN9的表达数据谱进行提取。利用R语言软件,计算并筛选出LIN9在LUSC中在表达水平上具有相关性的共表达基因(Co-Expressed Genes,CEGs),以及LUSC组织的差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)。随后,通过维恩图的绘制,确定出两组基因:一组是既与LIN9在表达水平上呈正相关,又在LUSC中表达上调的差异基因,二者基因集的交集;另一组是既与LIN9在表达水平上呈负相关,又在LUSC中表达下调的差异基因,二者基因集的交集。最后,基于上述两组基因分别进行基因功能富集分析,后者包括基因本体论(Gene Ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes,KEGG)通路、Reactome通路,以及疾病本体论(Disease Ontology,DO)等项目。5.本研究运用SPSS v26.0、Graph Pad Prism v8.0以及R语言v 4.0.2等软件进行统计学运算及作图,实验数据以“Means±Standard Deviation(X±SD)的形式表示。对于计量资料,若一个因素中含有两个亚组,则采用t检验的统计学方法进行分析;若一个因素中含有三个亚组,则采用方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)的统计学分析进行分析;对于计数资料,采用卡方检验的统计学方法进行分析。若p0.05,则提示差异