氯化两面针碱调控Bel-7402细胞线粒体自噬与凋亡的关系研究

作     者：廖艺楠 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：冯洁

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：氯化两面针碱 细胞凋亡 线粒体自噬 活性氧 线粒体损伤 

摘      要：氯化两面针碱(Nitidine chloride,NC)是从中药两面针Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.的根中分离到的一种生物碱,大量研究显示,NC能通过多途径诱导结肠癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤细胞凋亡,但NC的抗肿瘤机制研究主要集中于细胞凋亡的诱导,其余机制尚待进一步深入探讨。目的:本研究拟通过体外细胞学实验研究天然化学成分NC抑制肝癌细胞的分子机制,探讨NC对肝癌细胞线粒体的影响,探究NC是否能影响Bel-7402细胞的线粒体自噬,以及NC调控的线粒体自噬与细胞凋亡的关系,为NC作为新型的抗肝癌药物进入临床应用提供前期实验研究。方法:1.采用CCK-8法检测细胞活力变化,乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测胞毒性,探究NC对人肝癌Bel-7402、SMMC-7721、Huh-7、Hep G2、MHCC-97H细胞株增殖的影响,并选择抑制效果最好的细胞系进行后续试验;通过AO-EB染色法、Annexin V-FITC/7-AAD荧光双染法检测NC对细胞凋亡的影响。2.分别通过激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜观察NC处理前后线粒体的形态和结构的改变;通过检测ATP水平反映线粒体功能的改变,探究NC对Bel-7402人源肝癌细胞线粒体的损伤作用。3.采用DCFH-DA探针将细胞染色后,用流式细胞仪检测胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平;在加用ROS淬灭剂N-乙酰-半胱酰胺(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)预处理的基础上,给药后分别检测细胞活力、LDH水平和细胞凋亡率的改变。通过免疫印迹法(Western blot,WB)检测细胞Akt和p-Akt的蛋白表达量,探究ROS水平的变化对细胞凋亡的影响及分子机制。4.通过WB检测细胞mito-LC3的蛋白表达量;利用Mito-Tracker Green标记线粒体,Lyso-Tracker Red标记溶酶体,在激光共聚焦显微镜下观察溶酶体与线粒体是否存在共定位,检测线粒体自噬水平的改变。通过实时荧光定量PCR和WB检测线粒体DNA拷贝数和线粒体内膜蛋白COXIV表达水平,反映线粒体的数量变化。5.通过WB检测PINK1和Parkin蛋白表达量的变化,探究NC调控线粒体自噬的机制。最后通过加用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1后检测Bel-7402细胞活力和凋亡率,探究NC调控的线粒体自噬与细胞凋亡之间的关联。结果:***以浓度依赖性的方式抑制人肝癌细胞Bel-7402、SMMC-7721、Huh-7和Hep G2增殖,且对Bel-7402细胞的抑制能力最强。NC能显著提高Bel-7402细胞培养液中LDH水平,并诱导Bel-7402细胞凋亡。***能引起Bel-7402细胞线粒体形态和结构改变:激光共聚焦显微镜下观察到线粒体由正常的细丝状变为短棒状甚至碎片状;在透射电子显微镜下观察发现,NC治疗后细胞线粒体肿胀明显,嵴结构溶解;此外,不同浓度NC处理组细胞内ATP含量均有不同程度的下降。提示NC处理使线粒体损伤,引起线粒体形态、结构改变,功能受损。***能促进Bel-7402细胞内ROS含量增加,p-Akt/Akt表达水平降低;NAC预处理细胞后,一定程度上逆转细胞活力、LDH水平和细胞凋亡率,同时能恢复部分p-Akt/Akt表达水平。***结果显示,NC能浓度依赖性降低mito-LC3蛋白表达水平;激光共聚焦显微镜下观察到,NC处理后溶酶体与线粒体几乎不存在共定位;线粒体DNA拷贝数和线粒体内膜蛋白COXIV表达水平均随着NC浓度升高而增加。***以浓度依赖性的方式抑制Bel-7402细胞PINK1和Parkin蛋白的表达;Mdivi-1联合NC处理Bel-7402细胞可显著增强NC对细胞增殖的抑制,同时促进NC诱导的细胞凋亡。结论:1.本研究通过体外细胞实验,证明NC能抑制人肝癌细胞Bel-7402生长,并诱导细胞凋亡;***可促进细胞内ROS水平升高,且能通过介导ROS/Akt信号通路诱导人肝癌细胞凋亡;***可引起线粒体形态、结构和功能损伤,并能抑制PINIK1/Parkin通路介导的线粒体自噬;***通过抑制线粒体自噬,进而抑制细胞增殖,并促进Bel-7402人肝癌细胞凋亡。