UHRF1在小鼠精原干细胞维持及分化中的功能与机制研究

作     者：周淑敏 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：袁水桥

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：精子发生 精原干细胞 表观遗传 基因敲除 可变剪接 snRNAs 

摘      要：第一部分UHRF1蛋白在小鼠精原干细胞中的表达与功能研究【目的】哺乳动物的精子发生和男性生育力的长期维持依赖于精原干细胞的稳态。一方面,精原干细胞作为生殖干细胞,需要像胚胎干细胞一样增殖分化,通过自我更新维持相对稳定的数量。另一方面,精原干细胞经历分化最终生成精子。然而,关于精原干细胞稳态的维持机制目前并不十分清楚。本部分研究旨在明确具有植物同源域和环指结构域的泛素样蛋白1(Ubiquitin-like with plant homeodomain and RING finger domains 1,UHRF1)在小鼠精原细胞中的表达水平以及细胞定位模式,揭示UHRF1在精原干细胞稳态维持中的功能。【方法】利用免疫荧光、生物信息学分析研究在睾丸中UHRF1的表达及定位;通过Cre-Loxp系统构建前精原细胞中条件性敲除Uhrf1基因的小鼠模型(Uhrf1;Vasa-Cre);通过生育力测试、睾丸形态学分析等方法来探索UHRF1缺失对小鼠精原干细胞稳态的影响。【结果】结果发现在前精原细胞中特异性敲除Uhrf1导致雄性小鼠睾丸体积显著减小,并最终导致其完全不育。此外,结果还发现相较于对照小鼠睾丸组织,Uhrf1缺失的曲细精管中,分化的精原细胞数目以及未分化的精原细胞数目均显著减少,且呈现为年龄依赖性。【结论】UHRF1在精原干细胞稳态中具有重要的调控作用,前精原细胞中UHRF1的缺失会导致精原干细胞分化障碍,引起唯支持细胞综合征,最终导致雄性不育。第二部分UHRF1蛋白在小鼠精原干细胞发育中的调控机制研究【目的】近年来的研究表明,前体mRNA(premessenger RNA,pre-mRNA)的可变剪接可以发生在染色质附近,并且与组蛋白修饰有密切联系。UHRF1是一种重要的表观遗传调控因子,在多种组织中发挥表观遗传调控作用。然而,UHRF1是否参与premRNA的可变剪接并不十分清楚。因此,本课题旨在探讨UHRF1介导的pre-mRNA可变剪接调控小鼠精原干细胞发育的潜在作用机理。【方法】通过磁珠分选的方法分离小鼠精原干细胞;提取精原干细胞总蛋白进行免疫共沉淀-质谱以寻找UHRF1的互作蛋白;通过RNA测序和生物信息学分析检测premRNA可变剪接的差异;通过RNA免疫沉淀寻找UHRF1所结合的pre-mRNA。【结果】结果显示UHRF1与众多RNA结合蛋白互作,并且与sn RNAs中的U1、U2和U4也存在很强的相互作用。此外,研究结果发现UHRF1可以结合到精原干细胞稳态相关基因的pre-mRNA上,且前精原细胞中特异性敲除Uhrf1可导致RNA的可变剪接显著异常,其中外显子跳跃是发生率最高的可变剪接事件。富含尿嘧啶的小核糖核酸(U1、U2、U4/U6和U5 sn RNAs)和小核核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoproteins,sn RNPs)【结论】UHRF1与小核核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoproteins,sn RNPs)相互作用;UHRF1可以结合到富含尿嘧啶的小核糖核酸(uridine-rich small nuclear RNA,U sn RNAs)上;UHRF1可以结合到精原干细胞稳态相关的pre-mRNA上;UHRF1可以调控pre-mRNA的可变剪接。