斑马鱼Mpr5基因敲除亚系的突变表型鉴定及功能分析

作     者：陈金霞 

作者单位：湖南师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王跃群;吴秀山

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：心脏发育 Mpr5 Foxp4 斑马鱼 

摘      要：心脏病是死亡率最高的疾病,其中先天性心脏病(先心病)在我国出生缺陷病例中占到26.7%,且呈逐年上升趋势。研究表明,心脏发育基因的突变与表达异常以及环境影响均可能造成心脏发育异常,发展为先心病,而环境影响导致的先心病也是通过诱发基因突变或表达异常造成的,因此,对心脏发育基因的研究尤为重要。Mpr5基因是本实验室筛选鉴定的一个与心脏发育有关的候选基因,前期已利用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中建立了Mpr5基因敲除系。在此基础上,本研究对Mpr5基因敲除系的其中一个亚系(缺失8 bp)进行了突变表型的鉴定及其相关功能的初步分析,主要研究内容如下:1.首先利用变性聚丙烯酰酸胺凝胶电泳鉴定筛选出稳定纯合的Mpr5亚系,通过与野生型(WT)斑马鱼对比统计分析其死亡率和畸形率,发现其死亡率在12 h达到最高(34.24%),这说明Mpr5敲除亚系纯合子斑马鱼早期畸形胚胎多数不易成活。通过对48 h畸形胚胎的观察,发现其畸形主要为心脏形态异常:线性化心管(25.15%)以及心包过大(22.63%),说明Mpr5基因对心脏形态结构的发育是必需的。2.为了探究Mpr5基因在影响心脏形态发育时是否对心功能产生了影响,将Mpr5亚系畸形胚胎置于高速成像显微镜下录制20 s心脏跳动的视频,SOHA分析其结果表明:Mpr5畸形胚胎较WT胚胎,平均心率由145.50±205.63次/min降低为88.27±411.38次/min、心动周期由0.4304±0.0030 s延长到0.7451±0.0474 s、收缩期表面积由43986±18467μm降低为29205±9218μm、舒张期表面积由25946±12679μm降低为24269±27265μm以及收缩与舒张心脏腔室表面积变化率由0.40±0.03增加为0.48±0.02,且差异均有统计显著性,进一步表明Mpr5基因影响斑马鱼的心功能。3.通过SOHA软件进行M-Mode分析:Mpr5与WT相比舒张间隔与收缩期间隔的不规律性增加,且相比WT收缩期间隔与舒张期间隔都有所上升。SOHA软件模拟人类心率曲线得出的结果中Mpr5心肌收缩力确有下降,且心率不齐。因而推测,Mpr5心脏畸形主要影响了心肌功能,导致心脏收缩期与舒张期增加和心率不齐。4.为了研究Mpr5基因具体是怎样调控心脏发育的,本文选取了与早期心脏发育相关的基因进行q PCR分析,研究结果发现在24 hpf的Mpr5斑马鱼胚胎中,Nkx2.5、Gata4、Mef2c、Tbx1、Fgf8、Fgf10、Smyd1a、Hand2与Smyd1b表达均下降且有统计显著性,Foxa2和Tbx20表达则有所上升有统计显著性,而Isl1结果没有统计显著性。说明敲除Mpr5可能对早期心脏发育相关信号通路产生了一定的影响,其具体路径中的基因相互作用有待进一步研究。5.已知Foxp4调控心脏的形成,本实验室前期发现Mpr5可能调控Foxp4的表达。本文利用q PCR实验所得结果显示:在24 hpf的Mpr5斑马鱼胚胎中,Foxp4的表达量有所下降,且具有统计显著性,表明Mpr5调控Foxp4的表达。然后利用双荧光报告酶系统探讨Mpr5对Foxp4可能具有的转录调控作用,发现转染过表达Mpr5质粒与质粒p GL3-Foxp4(-3219～+175 bp)的双荧光素酶活性增强,表明Mpr5激活Foxp4基因启动子的转录活性,而转染过表达Mpr5质粒与Foxp4启动子亚克隆质粒p GL3-F1(-2719～+175 bp)的双荧光素酶活性受到抑制。利用生物信息学分析Foxp4基因启动子上游-3219～+175 bp内含有2个Mpr5结合位置(Z-Motif-1和Z-Motif-2),可能具有转录激活作用。进一步的Ch IP实验为Mpr5可能结合在这个预测的Foxp4基因启动子特定区域提供了实验证据。综上所述,本文主要对斑马鱼Mpr5基因敲除亚系的突变表型进行了鉴定和基因功能的初步分析。实验证明Mpr5基因对心脏形态发育起着重要的调控作用,并对心功能产生了影响。Mpr5调控早期心脏发育基因的转录表达,其中,可能通过结合在Foxp4基因启动子上调控Foxp4的转录。