β-1，3-木聚糖酶祖先序列重建及水解产物类型改造

作     者：曾波 

作者单位：华侨大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张光亚

授予年度：2022年

学科分类：081705[工学-工业催化] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 080502[工学-材料学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 

主      题：β-1,3-木聚糖酶 祖先序列重建 数据挖掘 功能性寡糖 低聚寡糖制备 

摘      要：β-1,3-木聚糖酶(EC 3.***.1.32)可以水解β-1,3-木聚糖,其水解产物中的单糖(木糖)可用于高附加值化学品的生产,如木糖醇、2,3-丁二醇等;而β-1,3-低聚木糖则具有多种生物活性,如抗氧化活性、抗凝血活性和抗肿瘤活性(例如人乳腺癌细胞MCF-7)。因此,β-1,3-木聚糖酶在生物资源利用和寡糖制备领域具有潜在的应用前景。目前,已报导的β-1,3-木聚糖酶催化性能不高,限制了其在工业上的应用。此外,未来酶法制备功能性寡糖将会替代化学法。然而,大部分酶的水解产物中都会有对应的单糖存在,一些单糖的占比甚至超过20%,这对于制备高纯度寡糖来说是不利的。基于此,本论文主要开展以下工作:首先,为提升β-1,3-木聚糖酶在工业上的应用水平,本文提出并使用优化的祖先序列重建策略来提升β-1,3-木聚糖酶催化性能。本文重建了6个祖先β-1,3-木聚糖酶,通过分子对接和动力学模拟筛选得到了预期目标的祖先Anc Xyl09,并进行实验表征验证。结果表明,Anc Xyl09底物谱发生改变且具有高热稳定性,具有工业化应用潜力。Anc Xy09的最适温度为55℃,p H为6.5,属于中温的β-1,3-木聚糖酶。50℃半衰期为65.08 h,具有良好的热稳定性。本文通过蛋白互作网络和分子动力学模拟分析,发现氢键和二硫键是维持Anc Xyl09热稳定性的主要原因。有趣的是,β-1,3-木聚糖酶(Anc Xyl09)除了能水解原始底物β-1,3-木聚糖外,还能水解地衣多糖,这是首次报道底物谱发生改变的β-1,3-木聚糖酶。Anc Xyl09在水解β-1,3-木聚糖和地衣时,水解产物以双糖为主,分别反应24 h后β-1,3-木二糖占比为79%,地衣二糖占比为76%,可显著简化低聚寡糖的分离纯化步骤。Anc Xyl09水解产物(β-1,3-低聚木糖、地衣寡糖)具有良好的抗氧化性,在1.5 mg/ml时,对羟基自由基的清除活性均达到100%。其次,制备寡糖的酶水解产物中都会有对应的单糖单元存在。为了改造及筛选只产生特定寡糖的水解酶(GH),本文提出了一种改造、筛选酶水解产物类型的新策略,为挖掘只产生特定寡糖的水解酶(GH)提供了有效工具。第一步,将重建的祖先β-1,3-木聚糖酶作为潜在的只产特定寡糖的筛选数据库。通过分子对接,本文采集了影响β-1,3-木聚糖酶水解产物类型的因子。通过对水解产物类型进行数值编码并对数据集进行训练,本文建立了两种数据挖掘算法。它们为非线性Logit Boost分类器和线性PLSR分类器,对“寡糖这种类型的预测准确率可达100%,用于预测祖先β-1,3木聚糖酶水解产物的类型。第二步,通过两种算法对剩余的5个祖先蛋白进行筛选,最后本文选取了水解产物类型预测为只有寡糖的祖先β-1,3-木聚糖酶Anc Xyl10进行表征。其水解产物仅为寡糖(β-1,3-木二糖和β-1,3-木三糖),实验结果与两者预测模型结果一致,进一步证明了预测器的可靠性。这是第一个通过祖先序列重建方法改变水解产物类型的成功案例,Anc Xyl10在制备高纯度β-1,3-木糖聚寡糖方面具有应用潜力。第三步,本文结合实验结果和ASR过程(序列Gap处理和古代氨基酸置换)对Anc Xyl10的水解产物类型改变的分子机制进行探究,发现序列Gap处理和古代氨基酸置换影响了5个重要因子,导致β-1,3-木二糖和β-1,3-木三糖不能继续被水解,也导致不能产生三个以上木糖单位的低聚糖。综上所述,本研究使用优化的祖先序列重建策略成功提升了β-1,3-木聚糖酶的催化能力,在酶设计中具有潜在的应用价值,为β-1,3-低聚木糖、地衣寡糖制备及海藻资源利用提供了新的思路。其次,使用一种改造、筛选酶水解产物类型的新型组合策略成功应用于β-1,3-木聚糖酶,为改造及筛选只产生特定寡糖的水解酶提供了有效工具。Anc Xyl10水解产物类型改变的分子机制(五个因子及ASR过程),可为改造其他碳水化合物水解酶以产生特定寡糖提供了新的思路。两种策略的提出及其在β-1,3-木聚糖酶的成功应用,相较于传统方法,有利于避免实验盲目性并减少实验工作量,在酶的热稳定性,改变底物谱,水解产物类型的改造、筛选中具有很大的应用潜力和价值。