禁食减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤及其机制

作     者：周详 

作者单位：中国人民解放军空军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：余志斌;张琳

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：急性高原缺氧 禁食 mTOR 心肌缺血再灌注损伤 细胞焦亡 自噬 细胞凋亡 

摘      要：随着海拔的升高,空气中的氧分压(oxygen partial pressure,PO2)不断降低,当人体在短时间内快速进入高海拔环境则会因缺氧造成不同程度的症状和体征,甚至损害。我国幅员辽阔,高原边境线长,中印边界线长达2000公里,平均海拔在4500米(m)以上,领土纷争不断。当突发军事对抗时,需要将部队快速投送作战,如何降低部队战士急进高原遂行军事任务时高原反应的发病率、减少非战斗减员是一个亟待解决的难点问题,但当前机体急性缺氧适应的机制未能完全阐明。课题组建立了一种能快速增强缺氧耐力的禁食大鼠模型,禁食72h能够有效提高SD大鼠在模拟7620米海拔环境的存活率。心脏不停搏动,是人体对缺氧极其敏感的器官之一,禁食可提高大鼠急性缺氧耐力,是否亦能提高心肌组织缺氧耐力而对缺血再灌注心肌具有保护作用,值得进行研究。心肌缺血再灌注(ischemia and reperfusion,IR)损伤是指冠状动脉部分或完全急性阻塞后,在一定时间又重新获得再通时,缺血心肌虽然得以恢复正常灌注,但其组织损伤反而呈进行性加重的病理过程。缺血期引起的心肌超微结构、能量代谢、心功能和电生理等一系列损伤性变化;再灌注早期对心肌的损伤更为突出,包含括心肌重构、炎症应答、氧化应激、能量代谢紊乱和细胞凋亡等,其中经内源信号诱导NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3,NLRP3)炎性体组装所启动的细胞焦亡是再灌注损伤的重要机制之一。再灌注后期心肌发生修复作用,可部分修复心肌功能。本实验室已证明禁食通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号转导途径,抑制蛋白与脂肪合成代谢,从而减少组织细胞内非必须三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)消耗量,同时激活线粒体自噬,预先清除老化或微损伤线粒体,防止缺氧条件下的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)过度增多,增强线粒体氧利用效率,从而提高了机体缺氧耐力。这些机制在心肌的缺血期,在有限时间内可能保障必须ATP供给量,防止对心肌造成损伤,在再灌注期,自噬增强可能抑制心肌细胞焦亡,亦可发挥保护作用。因此,本研究拟以SD大鼠为研究对象,结合分子影像手段,观测禁食对缺血再灌注心肌的保护作用及其机制,为建立心脏的多靶点保护策略提供实验数据与新思路。目的:1.观测禁食对大鼠心肌葡萄糖摄取的影响;2.观测禁食对大鼠缺血再灌注损伤心肌梗死(myocardial infarction,MI)面积的影响;3.探明禁食对大鼠缺血再灌注损伤心肌具有保护作用的机制。方法:1.取SD(Sprague-Dawley)大鼠尾静脉血液,使用血糖血酮仪分别检测不同禁食时间组的血糖和血酮水平。2.结扎大鼠冠状动脉左前降支(left anterior descending branch,LAD)30 min后解除结扎,制备心肌IR损伤模型,在术后3h、4d与7d观测不同指标的变化。3.设置三组:大鼠行开胸术但不进行LAD结扎,作为假手术组(Sham组);同步对照组大鼠行IR术(CON-IR组),大鼠禁食72h但不限制饮水,再行IR术(F72h-IR 组)。4.采用M型超声心动图测量大鼠禁食过程和缺血再灌注后不同观测时间点的心脏泵血功能。5.TTC(triphenyltetrazolium chloride)染色法测量大鼠缺血再灌注不同时间心肌梗死面积。6.氟-18-脱氧葡萄糖(F-18 fluorodeoxyglucose,18F-FDG)正电子发射计算机断层显像(Positron Emission Tomography/Computed Tomography,PET/CT)显像,在活体上观测大鼠心肌代谢转化过程和缺血再灌注后FDG摄取和心肌缺损情况。7.镓-68-成纤维细胞活化蛋白抑制剂(Ga-68 fibroblast activation protein inhibitor,68Ga-FAPI)04 PET/CT显像,在活体上观测大鼠缺血再灌注后心肌成纤维细胞活化水平。8.培养大鼠心肌H9C2细胞系,并通过蛋白免疫印迹和免疫荧光方法检测不同葡萄糖浓度培养对心肌细胞mTOR和腺苷酸激活蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)表达与活性的影响。9.通过蛋白免疫印迹、免疫荧光观察禁食72h对大鼠缺血再灌注心肌mTOR、AMPK表达与活性、自噬通量、炎性反应和细胞凋亡率的影响。结果:1.禁食24h引起体重与血糖的显著性降低和血酮升高,禁食48h-72h,观测到进一步的体重、血糖降低与血酮升高,并达到一定的平衡状态,且在恢复饮食24h后恢复正常;禁食大鼠心率(heart rate,HR)、左心室射血分数和短轴缩短率在Control,F24h,F48h,F72h各组无显著差异;禁食大鼠心肌18F-FDG摄取和SUV水平随禁食时间的延长不断下降且在恢复饮食24h后恢复正常。2.经Western blotting和免疫荧光实验证实,不同浓度葡萄糖培养基培养心肌细胞系H9C2 72h,随着葡萄糖浓度降低,心肌细胞mTOR活性降低,AMPK活性增高。3.与假手术组(Sham)相比,同步对照大鼠缺血再灌注3h、4d与7d组(CON-IR-3h、CON-IR-4d与CON-IR-7d)的左心室射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)显著降低,禁食 72h 各组(F72h-IR-3h、F72h-IR-4d 与 F72h-IR-7d)的 EF 与 FS 亦下降,但显著高于同步对照各组。同步对照大鼠缺血再灌注4d与7d(CON-IR-4d与CON-IR-7d)组的18F-FDG摄取下的心肌缺损面积显著大于禁食72h组(F72h-IR-4d与F72h-IR-7d)。同步对照大鼠缺血再灌注4d与7d(CON-IR-4d与CON-IR-7d)组的心肌组织TTC染色显示,心肌梗死面积显著大于禁食72h各组(F72h-IR-4d与F72h-IR-7d)。同步对照大鼠缺血再灌注4d与7d(CON-IR-4d与CON-IR-7d)组心肌梗死区的68Ga-FAPI摄取SUV水平显著高于禁食72h组(F72h-IR-4d 与 F72h-IR-7d)。4.禁食大鼠缺血再灌注早期心肌mTOR活性降低,AMPK活性增高;禁食使缺血再灌注过程心肌细胞自噬通量增高;禁食大鼠缺血再灌注中期心肌组织NLRP3炎性体被抑制;禁食降低大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡执行蛋白分子Caspase 9与Caspase 3的激活水平。结论:1.禁食缩小大鼠缺血再灌注心肌急性期与恢复期的梗死面积;2.禁食对大鼠缺血再灌注心肌急性期发挥保护作用的机制可能为减少非必要ATP消耗,相对提高ATP生成;3.禁食逆转大鼠缺血再灌注心肌恢复期的重塑,其机制可能为抑制炎性反应。综上所述,禁食对大鼠缺血再灌注心肌损伤在急性期与恢复期,均具有明显的保护作用,其机制可能为抑制mTOR而减少合成代谢消耗ATP,减小缺血急性期的损伤;在恢复期因增强自噬而抑制细胞焦亡诱发的炎性反应,促进心肌的修复。