大豆油体蛋白基因GmOLE1和GmOLE2功能的初步研究

作     者：郭新亚 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：章文华

授予年度：2020年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：油脂 油体蛋白 脂肪酸 TAG含量 冻害 抗逆性 

摘      要：植物的油脂不仅能为自身生长发育提供能量,还可以为人类提供食物,制作医药品、日用化工产品和替代能源等。高等植物体内的脂肪酸(fatty acid,FA)合成是一个复杂且涉及多种酶系参与的重要生理代谢过程。植物油脂一般以三酰甘油(triacylglycerol,TAG)的形式贮藏在植物种子油体(oilbody,OB)中,为种子萌发提供大量的能量。油体蛋白(oleosin,OLE)作为油体的重要组成结构,是大小约为15-25 KD的小分子蛋白,具有特殊且高度保守的超长疏水结构。正是油体蛋白特殊的蛋白结构,使它具有维持油体大小稳定油体结构的功能,还参与脂质合成与代谢。我国是作为食用植物油的消费大国之一,对外进口依赖性大,除了增加油料作物的种植面积外,提高油料作物种子含油量成为提高产量的关键。本文通过利用拟南芥转基因材料和酵母体系研究分析大豆油体蛋白GmOLE1和GmOLE2在脂合成与代谢中的作用和在植株生长发育过程中的生理生化功能。主要研究内容和结果如下:1.通过对GmOLE1和GmOLE2蛋白序列分析发现其不仅具有特殊“脯氨酸结(knotmotif)保守结构域,蛋白中间还具有超长疏水结构而两端具有两亲性的α-螺旋结构(兼具亲水性和亲脂性),但GmOLE1的等电点为6.90而GmOLE2的等电点为9.26,存在较大差异。酵母系统验证GmOLE1和GmOLE2蛋白参与酰基转移的过程,且过表达GmOLE1和GmOLE2导致酵母油脂中C16:0和C18:0饱和脂肪酸显著下降,减少25%-30%,而C24:0超长链脂肪酸含量极显著增加约30%-35%。2.相比于野生型,过表达GmOLEs拟南芥植株成熟种子总蛋白含量显著增加,提高约20%;而总可溶糖的含量显著下降,减少约10%;总油含量相比于空载体减少约8%而比野生型减少10%,其中C16:0(棕榈酸)和C18:3(亚麻酸)含量明显下降,减少8%,而C18:1(油酸)含量明显上升,增加10%。转基因株系叶片的TAG含量中C20:0(花生酸)的含量显著下降,减少约8%,而DAG含量中各脂肪酸含量无显著变化。3.定量检测过表达GmOLE1和GmOLE2的拟南芥幼嫩果荚中与甘油合成、代谢途径相关的一些关键基因,发现在过表达GmOLE1果荚中,内源油体蛋白如AtOLE1、AtOLE2等基因表达量都显著下降,减少一倍,而具有酰基转移酶功能的AtDGAT1表达量显著提高;在过表达GmOLE2果荚定量结果截然不同,内源油体蛋白AtOLE1、AtOLE2等基因表达量增加了 5-10倍。4.过表达GmOLE1或GmOLE2基因对拟南芥植株生长发育均无不良影响的情况下,可以提高单果英种子数和单株种子总重量。5.在冻害处理条件下,过表达GmOLE2拟南芥纯合种子较野生型拟南芥种子萌发率显著提高,但过表达GmOLE1的种子与野生型无明显差异。用10 μM茉莉酸甲酯(MeJA)处理野生型和过表达GmOLE1和GmOLE2纯合拟南芥的幼苗,发现两者主根都受到抑制的情况下,过表达GmOLE1和GmOLE2幼苗侧根丰度及长度显著高于未处理组,且在过表达GmOLE1和GmOLE2的幼苗中GmOLE1和GmOLE2的表达量在24 h内提高了 5-10倍。相比于野生型,过表达GmOLE1和GmOLE2的拟南芥种子在含0.5 μM脱落酸(ABA)培养基上延迟萌发但其萌发率显著提高,GmOLE1和GmOLE2的表达量比未处理组高6-8倍。说明,GmOLE1和GmOLE2两个基因的表达都可被MeJA和ABA诱导,对于激素信号更加敏感,从而响应信号,提高植物抗逆性。综上所述,转GmOLE1和GmOLE2到拟南芥,影响种子脂肪酸组成,提高单不饱和脂肪酸的含量;降低油含量,提高蛋白含量。GmOLE1和GmOLE2提高拟南芥果英内种子数和单株种子总重量。且GmOLE1和GmOLE2影响拟南芥种子对非生物胁迫的响应,以及幼苗对MeJA和ABA的响应。这些发现为进一步研究油体蛋白及生理功能和作用机制提供一定价值的线索。