中华豆芫菁HMGR基因克隆及斑蝥素生物合成途径初探

作     者：姜鸣 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张雅林

授予年度：2012年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：斑蝥素 克隆 生物信息学 甲羟戊酸途径 保幼激素Ⅲ 康帕丁 

摘      要：斑蝥素(cantharidin,C10H12O4)是一种广泛存在于芫菁科及部分拟天牛科和蜡蝉科昆虫体内的萜类防御性毒素,不仅具有重要的医学价值,同时也具有很强的杀虫作用及抑菌、除草活性,在农业领域具有极大的潜在应用价值。由于原料缺乏而致斑蝥素无法进行大规模生产,这一直是限制其应用的一大障碍。为了从生物合成方面解决斑蝥素生产原料问题,本研究以中华豆芫菁Epicauta chinensis Laporte为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆了甲羟戊酸途径的关键限速酶——3-羟甲基戊二酰辅酶A-还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)基因,并对该基因及其编码的蛋白进行了生物信息学分析;同时通过向虫体内注射该酶的抑制剂康帕丁及基因表达激活剂保幼激素Ⅲ,观察注射后对虫体斑蝥素含量的影响,以此来推断斑蝥素在芫菁体内的合成是否与甲羟戊酸途径有关。主要研究结果如下:1.克隆得到了中华豆芫菁Epicauta chinensis Laporte HMGR基因全长cDNA序列共3167 bp,包含一个2595 bp的开放阅读框,共编码864个氨基酸,5’非编码区228 bp,3’非编码区344bp,其与辣根猿叶虫Phaedon cochleariae的HMGR cDNA序列一致性可达74%,与其他昆虫的HMGR cDNA序列一致性达60%以上,可初步判定克隆所得为中华豆芫菁HMGR基因,上传至GeneBank获得序列号为JX096638。2.生物信息学分析发现,中华豆芫菁HMGR蛋白预测的理论分子量为95.1 kDa,等电点pI=6.11,预测分子式为C4234H6765N1127O1247S53,不稳定系数为45.59,故推测此蛋白为不稳定蛋白,存在7个跨膜区,属于跨膜蛋白,有2个O-糖基化位点,4个N-糖基化位点和2个O-GlcNAc糖基化位点,不存在信号肽结构,可推测该蛋白是锚定于膜上起作用的非分泌型糖蛋白。二级结构预测中无规则卷曲占42.94%,α-螺旋占37.38%,延伸链占19.68%,三维结构在空间上折叠成“V字形,包含N-结构域、S-结构域和L-结构域三个结构域,其中L-结构域包含两个HMG-CoA结合基序和一个NADP(H)结合基序,S-结构域含一个NADP(H)结合基序。氨基酸序列同源性比对与辣根猿叶虫Phaedon cochleariae的相似度达到74.5%,与鳞翅目昆虫的相似度为46%～48%。3.康帕丁(1.6mM)注射实验结果显示,实验组其斑蝥素的平均含量为1.01%,对照组的平均含量为2.11%,统计学分析发现两者具有极显著差异(P0.01),说明注射了康帕丁溶液的试虫体内斑蝥素含量显著低于对照组。初步推断,芫菁体内斑蝥素的合成与HMGR蛋白调节有关。4.保幼激素Ⅲ(Juvenile hormone Ⅲ,JH Ⅲ)注射实验结果显示,实验组的斑蝥素平均含量为2.48%,对照组的斑蝥素平均含量为1.24%,统计分析表明两者具有显著性差异(P0.01),结果提示实验组蝥素含量明显高于对照组,推断保幼激素Ⅲ对芫菁体内斑蝥素合成有促进作用。同时发现,在保幼激素注射的不同处理时间组间,斑蝥素的含量表现出一种先增高后降低的趋势(6h至12h增加,12h至22h减少),但均高于同时间段的对照组,说明保幼激素的作用时效较短,这可能与其作为激素在体内起作用有关。5.通过对保幼激素Ⅲ注射实验试虫的HMGR基因表达检测发现,实验组的平均相对基因表达量为1.56,对照组的为0.68,说明注射保幼激素对芫菁体内的HMGR基因表达量有显著的增高,同时在保幼激素注射组内HMGR基因的相对表达量根据处理时间的不同,也表现出了先增高再降低的趋势(6h至12h增加,12h至22h减少)。6.结合分析保幼激素注射实验中试虫体内斑蝥素含量与其HMGR基因表达量的相关关系,结果表明试虫体内斑蝥素含量与HMGR基因表达量的相关系数R2=0.873,说明斑蝥素含量与HMGR基因表达量之间存在着显著的正相关关系,进一步推断出保幼激素对芫菁体内的斑蝥素合成有促进作用,斑蝥素的生物合成与甲羟戊酸途径相关。本研究首次克隆得到了中华豆芫菁HMGR基因的全长cDNA序列,并对其进行了相关的生物信息学分析,通过激活HMGR的基因表达及抑制其酶活性,得出斑蝥素在芫菁体内的合成与甲羟戊酸途径有关,并通过荧光实时定量RT-PCR的方法检测得到,HMGR基因的表达量与斑蝥素在芫菁体内的生物合成量具有一定相关性。