基于斑马鱼模型的水仙苷发育毒性及心可舒片抗心肌缺血活性研究

作     者：高硕 

作者单位：河北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李建恒;夏青

授予年度：2022年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：斑马鱼 水仙苷 发育毒性 心可舒片 抗心肌缺血 网络药理学 

摘      要：目的:本论文共包括两部分研究内容。第一部分,课题组前期筛选发现水仙苷具有潜在毒性,本研究拟利用斑马鱼模型系统评价水仙苷发育毒性,并探讨其毒性作用机制。第二部分,本研究拟建立并优化斑马鱼心肌缺血模型,利用斑马鱼和心肌细胞模型评价心可舒片抗心肌缺血活性,并结合网络药理学方法,初步探讨心可舒片抗心肌缺血活性成分及作用机制。方法:1、在第一部分研究中,以受精后4小时(hour post fertilization,hpf)的斑马鱼胚胎为模型,通过建立致死曲线,观察畸形形态,统计孵化率、畸形率,评价心脏结构和功能,检测氧化损伤和细胞凋亡,以及检查心肌组织病理学变化等方法,系统评价水仙苷发育毒性;进一步利用分子对接和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法,研究水仙苷发育毒性作用机制。2、在第二部分研究中,首先建立并优化斑马鱼心肌缺血模型,利用斑马鱼和大鼠心肌细胞(H9c2)2种心肌缺血模型,评价心可舒片抗心肌缺血活性;然后利用网络药理学方法预测心可舒片抗心肌缺血活性成分及作用机制,并开展实验验证;最后,利用心肌细胞缺氧模型和网络药理学方法,对主要活性成分紫草酸的抗心肌缺血活性及作用机制开展了进一步研究。结果:1、第一部分研究,发现水仙苷能够剂量和时间依赖性的导致斑马鱼死亡率增加,在非致死和亚致死浓度范围内,造成斑马鱼孵化率降低、畸形率升高、体长缩短,造成的主要畸形包括心包水肿、卵黄吸收延滞、体长缩短和下颌畸形,说明水仙苷对斑马鱼胚胎具有一定的发育毒性;通过进一步检测心脏结构和功能、氧化损伤和细胞凋亡以及心肌组织病理学变化,发现水仙苷处理组斑马鱼心功能显著下降,心脏区域活性氧含量和细胞凋亡数量显著增加,并且心肌组织也出现心肌细胞减少、核皱缩等病理改变,说明水仙苷对斑马鱼心脏发育具有毒性作用;分子对接和q RT-PCR实验结果显示水仙苷能稳定结合KEAP1、NRF2、CSAPASE-3等靶点,下调斑马鱼体内nrf2、ho-1、sod-1、sod-2、bcl-2等抗氧化和抗凋亡相关基因的表达,上调caspase-3和bax等促凋亡基因的表达,同时抑制atp2a1、atp2a2a、ryr2等多个Ca信号通路关键基因的表达,以上结果表明KEAP1-NRF2信号通路、线粒体凋亡信号通路和Ca信号通路可能在水仙苷导致的斑马鱼发育毒性和心脏发育毒性中具有重要作用。2、第二部分研究,建立并优化了ISO诱导的斑马鱼心肌缺血模型,结合心肌细胞缺氧损伤模型,发现心可舒片具有抗心肌缺血活性;网络药理学和实验验证结果表明心可舒片抗心肌缺血活性成分主要包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸D、紫草酸、迷迭香酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2和3’-羟基葛根素等,其作用机制与调控PI3K/AKT、FOXO、RAS等信号通路密切相关;此外,发现紫草酸可以显著提高心肌细胞存活率,减少乳酸脱氢酶生成和促进细胞增殖,其作用机制与调控MAPK、FOXO、PI3K/AKT等信号通路有关。结论:1、水仙苷对斑马鱼胚胎具有发育毒性,导致心包水肿、卵黄吸收延滞、体长缩短等畸形,尤其对心脏发育具有明显的毒性作用,其毒性作用机制与调控KEAP1-NRF2信号通路、线粒体凋亡信号通路和Ca信号通路导致的氧化应激、细胞凋亡和Ca通道障碍密切相关。本研究首次发现水仙苷具有发育毒性,为预防含水仙苷类产品的毒副作用和临床安全用药提供实验支撑和警示作用。2、心可舒片抗心肌缺血活性成分主要包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸D、紫草酸、迷迭香酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2和3’-羟基葛根素等,其作用机制调控PI3K/AKT、FOXO、RAS等信号通路密切相关;紫草酸抗心肌缺血活性显著,其作用机制与调控MAPK、FOXO、PI3K/AKT等信号通路有关。本研究为阐明心可舒片药效物质、作用机制和实现二次开发提供前期基础。