HDM通过激活铁蛋白自噬诱导哮喘中气道上皮细胞铁死亡从而促进炎症反应

作     者：曾昭锦 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蔡绍曦

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：哮喘 铁死亡 炎症 氧化应激 铁蛋白自噬 

摘      要：研究背景与目的哮喘是一种以气道上皮屏障破坏、慢性气道炎症和气道重塑为特征的疾病。环境中过敏原对气道上皮细胞的反复损伤在哮喘的病理生理过程中起重要作用。目前临床上对于哮喘的治疗方法和手段有限,寻找新的治疗方案一直是临床上的困难与挑战。铁死亡是一种新形式的程序性细胞死亡,由脂质过氧化和游离铁介导的铁促反应调控,同时死亡细胞释放大量损伤相关分子模式(DAMPs)和炎性介质,加重局部炎症反应和组织损伤。已经有研究表明铁死亡参与了多种疾病的发生发展过程,但铁死亡与哮喘的关系一直以来鲜有报道,抑制铁死亡过程是否会影响哮喘的发生发展仍有待研究。为此,在这项研究中我们通过体外实验和体内实验探究屋尘螨(HDM)诱导的哮喘模型中气道上皮细胞是否会发生铁死亡,如若发生,该过程的机制是怎样的,以及抑制铁死亡是否可以改善哮喘症状。研究方法1.体外实验:使用人支气管上皮细胞系,用KM培养基进行培养。根据实验需求用不同试剂处理细胞,通过蛋白免疫印迹检测GPX4、FTH、HO-1、Nrf2等铁死亡相关蛋白表达情况,荧光探针、CCK8等功能学实验检测细胞相关指标。2.体内实验:BALB/c小鼠随机分为4组:(1)control组;(2)HDM组;(3)HDM+DFO 组;(4)HDM+Fer-1 组。HDM 组、HDM+DFO 组、HDM+Fer-1组在第0天和第7天通过腹膜内注射0.2 ml含有HDM的生理盐水溶液对小鼠进行致敏。然后,在3周内每隔一天用0.02ml含有HDM的生理盐水溶液对小鼠进行鼻内激发,control组使用等量生理盐水。HDM+DFO组和HDM+Fer-1组在每次HDM激发前1小时腹膜内注射铁死亡抑制剂DFO(100mg/kg)和Fer-1(20mg/kg)。第28天处死所有小鼠,收集肺组织和肺泡灌洗液。通过H&E染色检测气道炎症细胞浸润情况,蛋白免疫印迹检测GPX4、TFH等蛋白表达情况,肺泡灌洗液细胞计数和Elisa测定分析炎症情况。研究结果1.在体内和体外实验中,HDM诱导气道上皮细胞发生铁死亡在细胞模型中,使用HDM刺激细胞可使GPX4表达量下降,细胞发生脂质过氧化,线粒体形态改变,敲低GPX4后则加重上述改变。给予细胞铁死亡抑制剂DFO和Fer-1后,上述改变都有所好转。在HDM诱导的小鼠哮喘模型中,也检测到气道上皮细胞GPX4表达量的减少,并且HDM组小鼠气道上皮细胞的死亡可以被DFO和Fer-1缓解。***和Fer-1抑制了 HDM诱导的炎症反应我们通过H&E染色、细胞计数、以及对相关炎症因子的Elisa检测发现HDM组小鼠气道炎症表现严重,具体表现为气道周围大量炎性细胞浸润、灌洗液中总细胞数和嗜酸性粒细胞数增加、2型炎症因子IL-4、IL-5、IL-13水平增加,而HDM+DFO组和HDM+Fer-1组这些改变有所减轻。表明抑制铁死亡在一定程度上可以减轻HDM诱导的T2型炎症反应。***使细胞铁离子水平增多,氧化应激加重我们发现HDM组小鼠肺组织中铁离子水平更高,脂质过氧化程度更严重。在细胞实验中,HDM可以使细胞铁离子水平增多,氧化应激加重,再给予细胞硫酸亚铁铵后,实验结果与HDM一致,表明HDM诱导细胞游离铁离子水平增加并促进氧化应激反应。***激活NCOA4介导的铁蛋白自噬我们通过免疫共沉淀实验发现HDM可以使细胞NCOA4与FTH有更高的结合度,并使FTH降解释放出铁离子,敲低NCOA4可使铁离子水平恢复正常。同样,抑制自噬也能使FTH降解减少,铁离子水平下降。表明HDM可以激活NCOA4介导的铁蛋白自噬,使铁蛋白降解,释放铁离子。结论***诱导气道上皮细胞发生铁死亡2.抑制铁死亡可以减轻HDM诱导的T2型炎症反应***诱导细胞游离铁离子水平增加并促进氧化应激反应***激活铁蛋白自噬导致铁离子水平增加