TRIM59影响巨噬细胞糖代谢及调控HIF-1α表达的作用研究

作     者：黄慧 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：闫东梅

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：TRIM59 巨噬细胞 糖代谢 HIF-1α TLR2 

摘      要：TRIM59（tripartite motif59,TRIM59）是三结构域超家族成员之一,有一个RING结构域、一个或两个Box盒、一个卷曲结构域和一个跨膜结构域,在肿瘤、表观遗传修饰、胚胎发育和自噬中发挥作用。本课题组前期工作发现TRIM59调控的巨噬细胞可显著抑制肿瘤生长,并且能够改善脓毒血症小鼠的炎症状态,而这主要是通过核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路和γ链Fc段（Fragment crystallizable,Fcγ）受体,进而抑制了巨噬细胞的炎性细胞因子和吞噬作用有关,但是否有其他机制还不清楚。细胞物质代谢与细胞功能密切相关,抗炎表型的巨噬细胞呈现糖酵解降低,氧化磷酸化增强的现象。然而,糖酵解产物乳酸却能在一定程度上减轻炎症,乳酸抑制脂多糖诱导小鼠巨噬细胞和体外人类外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）产生白细胞介素1β（interleukin-1 beta,IL-1β）,而这个作用是通过抑制NF-κB和炎症小体激活实现的。那么TRIM59是否影响巨噬细胞糖代谢,对于乳酸的分泌是否有影响还不清楚。此外,缺氧诱导因子-1α（hypoxia Inducible Factor 1 Alpha,HIF-1α）与糖代谢密切相关,也会调控乳酸生成相关酶,如乳酸脱氢酶。那么TRIM59是否能够调控HIF-1α的表达,其机制是什么也需要进一步探讨。研究方法培养TRIM59高表达RAW264.7细胞及对照以及TRIM59巨噬细胞条件性敲除小鼠的骨髓来源巨噬细胞。1)对TRIM59高表达RAW264.7巨噬细胞的转录组进行生物信息学分析,通过COG数据库、GO数据库和KEGG数据库,找到与糖代谢有关的差异表达基因,并分析其表达差异。2)提取TRIM59高表达RAW264.7细胞及对照细胞的培养上清,利用乳酸检测试剂盒进行乳酸检测。3)提取培养TRIM59高表达RAW264.7细胞及对照细胞的RNA,逆转录后,利用实时荧光定量PCR技术进行HIF-1α和Toll样受体家族（toll like receptor,TLRs）的表达检测。4)培养TRIM59条件性敲除小鼠骨髓衍生巨噬细胞（bone marrow derived macrophage,BMDM）,给予脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激后,提取RNA和细胞蛋白,分别利用实时荧光定量PCR技术和Western-blotting进行HIF-1α基因表达、HIF-1α、丙酮酸激酶同工酶2（Pyruvate kinase isozyme type M2,PKM2）和脯氨酰羟化酶（prolyl hydroxylase,PHD）的蛋白表达检测。研究结果1.生物信息学分析结果提示,TRIM59可以影响巨噬细胞糖代谢通过对高表达TRIM59的巨噬细胞及对照组进行差异表达基因COG、GO、KEGG聚类统计,我们发现在巨噬细胞中过表达TRIM59后,巨噬细胞的糖代谢相关基因变化显著,涉及糖酵解、磷酸戊糖途径和氧化磷酸化相关基因,其中上调的基因有Hk3、Acyp1、Hagh、Pck2、Sord、Acss2、Arid5a、Adh7,下调的基因有Gmppb、L2hgdh、Aacs、Hk2、Hmgcs1、Pfkl、Acly、Idh1、Ldha、Tpi1、Pfkfb1、Eno4。由此可见,TRIM59可以调控巨噬细胞的糖代谢,尤其影响糖酵解相关基因较多。在炎症相关因子中,IL23a和Il10rb有上调趋势,下降较明显的是Il11、Il1b、Il21r和Il18rap,其他因子如IL4ra、Il6ra和Il1rap则变化不明显。在肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,Tnf）相关分子中,Tnf、Tnfsf13b、Tnfrsf8和Tnfrsf11a均有所下降。在干扰素（Interferon,IFN）相关分子中,下降的基因有Ifnar2。***59促进RAW264.7巨噬细胞乳酸分泌我们对TRIM59高表达RAW264.7细胞及对照细胞培养上清中的乳酸进行测定。结果发现,RAW264.7细胞中TRIM59高表达后,乳酸含量明显升高。***59可影响RAW264.7巨噬细胞HIF-1α、TLR2的表达我们发现TRIM59高表达后,RAW264.7巨噬细胞中Hif-1α和Tlr2的基因上调表达。***59缺失后,巨噬细胞HIF-1α表达下调为了明确在炎症状态下TRIM59对巨噬细胞HIF-1α表达的影响,我们用LPS刺激TRIM59缺失鼠的BMDM后,检测了Hif-1α的基因表达情况,结果发现Hif-1α的基因表达有所下降。而在蛋白水平的研究发现,LPS刺