二茂铁衍生物对急性T淋巴细胞白血病的作用及机制研究

作     者：曾了 

作者单位：华侨大学 

学位级别：硕士

导师姓名：崔秀灵;李纯团

授予年度：2021年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：T-ALL 二茂铁衍生物 细胞凋亡 细胞周期 PI3K/Akt/m TOR 

摘      要：背景急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)是一种具有侵袭性以及高度异质性的血液恶性肿瘤疾病,与其他急性淋巴细胞白血病相比,T-ALL具有预后差、复发率高等特点。目前主要的治疗方案仍为联合化疗,但由于传统的化疗药物毒副作用大,因此急需开发出低毒、高效且具有选择性的药物。目的本研究旨在筛选出活性较强的新型二茂铁衍生物,探究其在体外对T-ALL细胞增殖能力的影响以及相应的作用机制,为临床上抗T-ALL新型药物的开发提供前期理论和实践基础。方法采用CCK-8法检测新型二茂铁衍生物F1和F3对Jurkat细胞和正常细胞增殖的影响,计算IC值;PI单染法检测F1和F3对细胞周期的影响;荧光倒置显微镜观察Hoechst 33258染色后F1和F3处理的Jurkat细胞形态学变化;流式细胞术检测F1和F3对Jurkat细胞凋亡率、线粒体膜电位的影响;DCFH-DA探针法检测胞内活性氧水平的变化;Western Blot法检测F1和F3对周期相关蛋白CDK6、Cyclin D1、P21、P27及凋亡有关蛋白Bcl-2、Bax、Cyto c、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、PARP的表达量影响;Western Blot法检测F1和F3对Jurkat细胞PI3K/Akt/mTOR信号途径蛋白Akt、mTOR、GSK-3β、p70 S6K以及对应的磷酸化蛋白p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)、p-mTOR(Ser2448)、p-GSK-3β(Ser9)、p-p70 S6K(Ser389)表达量的影响。结果1、通过CCK-8法筛选出活性较好的新型二茂铁衍生物F1和F3,并得出F1和F3在处理Jurkat细胞48 h后对应的IC值分别为18.17±1.23和27.73±0.97μM。除此之外,与阳性药相比F1和F3对正常细胞(Normal human T和HEK293)的毒性较低,具有一定的选择性。2、流式细胞仪检测结果显示F1和F3均能够将Jurkat细胞阻滞在G0/G1期,同时出现Sub-G1凋亡峰,并呈浓度依赖关系;且Western Blot法检测结果发现CDK6和Cyclin D1蛋白的表达量随着化合物F1和F3浓度的增加而呈下降趋势,P27和P21蛋白的表达则相反。3、经Hoechst 33258染色后发现凋亡细胞由于核固缩而导致核染色质凝集;Annexin V/PI结果表明F1和F3处理后的Jurkat细胞凋亡率增大;JC-1探针检测结果显示F1和F3作用后的Jurkat细胞线粒体膜电位呈下降趋势;进一步检测Jurkat胞内活性氧得出随着F1和F3浓度逐渐增加,活性氧水平逐渐上升;Western Blot法检测相关凋亡蛋白发现,F1和F3能使Jurkat细胞中Bcl-2蛋白的表达量呈浓度依赖性地降低,而Bax、Cyto c、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白表达量呈相反趋势,PARP蛋白特异性水解产物增加。4、Western Blot法检测结果表明,当化合物F1和F3浓度增加时,p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)、p-GSK-3β(Ser9)、p-mTOR(Ser2448)、p-p70 S6K(Ser389)磷酸化蛋白表达量下降,而Akt、GSK-3β、mTOR和p70 S6K总蛋白表达量无明显变化。结论1、新型二茂铁衍生物F1和F3可以选择性抑制Jurkat细胞增殖,并且呈浓度依赖关系;2、新型二茂铁衍生物F1和F3通过下调Cyclin D1、CDK6蛋白水平和上调P27、P21蛋白水平来阻滞Jurkat细胞停留在G0/G1期;3、新型二茂铁衍生物F1和F3从蛋白水平下调Bcl-2表达,上调Bax表达,调节Bcl-2/Bax比率使线粒体膜电位明显下降,激活Caspase蛋白家族,促使PARP发生剪切,增加胞内活性氧水平,通过活性氧介导的内源性线粒体途径使Jurkat细胞发生凋亡;4、新型二茂铁衍生物F1和F3通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号途径发挥阻滞Jurkat细胞周期、诱导Jurkat细胞凋亡的作用。综上所述,本文首次对新型二茂铁衍生物F1和F3的体外抗T-ALL作用进行了筛选,并对其作用机制进行了考察,为该类化合物抗T-ALL或其它肿瘤疾病的进一步研究提供了前期理论和实践基础。