橙色红曲菌Rab6基因和Rab17基因缺失菌株的构建及其功能分析

作     者：焦雪雪 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李燕萍

授予年度：2022年

学科分类：08[工学] 0822[工学-轻工技术与工程] 082203[工学-发酵工程] 

主      题：红曲菌 Ku70基因 基因敲除 Rab6蛋白 Rab17蛋白 桔霉素合成相关蛋白 共定位 

摘      要：红曲菌作为传统的药食同源微生物,可产生多种有益的代谢产物,如:红曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸等,但也会产生具有肾毒性的桔霉素,所以采用合适的方法研究红曲菌的代谢途径对促进其应用极为重要。丝状真菌的生长主要通过在菌丝的顶端延伸细胞壁和膜来实现,该过程与发生在Spitzenk(?)rper部分的胞吐作用以及发生在菌丝内的内吞作用密切相关。在真核细胞内,物质的运输是由囊泡来介导完成的。Rab蛋白是一种分子运输开关,在囊泡的形成、运输、融合等过程中发挥着重要作用。本文通过敲除橙色红曲菌AS3.4384的Ku70基因来建立红曲菌高效基因敲除系统,然后在此基础上敲除可能和红曲菌色素及桔霉素合成相关的Rab6基因和Rab17基因,来研究Rab6和Rab17蛋白在红曲菌生长代谢中的功能,接着通过构建同时带有m Cherry标记的桔霉素合成相关蛋白和带有e GFP标记的Rab17蛋白的菌株,来研究Rab17蛋白与桔霉素合成相关蛋白的共定位以及蛋白之间的相互作用。本研究为研究红曲菌的代谢过程提供理论依据,为促进红曲菌的安全应用奠定基础。主要研究内容如下:1.通过无缝克隆技术构建带有潮霉素选择标记的置换型Ku70基因打靶载体p CAMBIA-△Ku70(hph),然后通过农杆菌介导的转化将打靶载体转入橙色红曲菌AS3.4384中。经潮霉素抗性平板筛选及PCR验证获得了Ku70基因缺失菌株AS△Ku70。分析AS△Ku70与AS3.4384菌株的菌落形态、产孢能力,色素和桔霉素产量以及同源重组效率差异。结果表明,Ku70基因缺失不影响红曲菌的生长繁殖、产孢能力以及代谢产物色素、桔霉素的生物合成,且AS△Ku70菌株的同源重组效率提高6倍以上。AS△Ku70菌株可作为橙色红曲菌AS3.4384高效基因敲除的模式菌株,为后续的基因敲除提供研究材料。2.通过无缝克隆技术构建以G418抗性基因为选择标记的置换型Rab6基因打靶载体p CAMBIA-△Rab6(G418),然后通过农杆菌介导的转化将打靶载体转入红曲菌AS△Ku70中。经G418抗性平板筛选及PCR验证获得了菌丝生长受损的△Rab6异核体菌株,但是单孢分离后未获得纯合子,且△Rab6异核体菌株丢失。结果提示,Rab6基因缺失可能会导致红曲菌菌丝延伸严重受损,菌株死亡。Rab6蛋白可能在红曲菌核内体到高尔基体或高尔基体到内质网的物质运输中发挥重要作用,调控着红曲菌的菌丝延伸和极性生长。3.通过无缝克隆技术构建以G418抗性基因为选择标记的置换型Rab17基因打靶载体p CAMBIA-△Rab17(G418),然后通过农杆菌介导的转化将打靶载体转入红曲菌AS△Ku70中。经G418抗性平板筛选及PCR验证获到了菌丝呈絮状的△Rab17异核体菌株。结果表明,Rab17蛋白可能与红曲菌的核内体的成熟密切相关,其缺失可能会导致红曲菌菌丝无法正常生长,进而致死。而由于红曲菌的菌丝和孢子上有多个细胞核,Rab17可部分缺失,通过细胞核间的互补作用以△Rab17异核体的形式传代培养。4.借助农杆菌介导的转化技术将m Cherry和CtnE/CtnH/Orf1/Orf5融合表达载体转入红曲菌AS3.4384::Rab17中,经G418抗性平板筛选及PCR验证获得了同时过表达带有m Cherry标签的桔霉素相关蛋白和带有e GFP标签的Rab17蛋白的AS3.4384::Rab17::ctnE、AS3.4384::Rab17::ctnH、AS3.4384::Rab17::orf1和AS3.4384::Rab17::orf5菌株。孢子培养40 h左右,Rab17蛋白和CtnE蛋白在部分菌丝和闭囊壳上有共定位,和CtnH蛋白在闭囊壳上有共定位,和Orf1蛋白在菌丝分枝处类似液泡的结构、细胞膜和闭囊壳上有共定位,和Orf5蛋白在菌丝细胞膜和闭囊壳上有共定位。结果表明,Rab17蛋白可能与桔霉素合成相关蛋白有相互作用,Rab17蛋白可能参与红曲菌生长、繁殖过程及色素、桔霉素的生物合成。