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多态性BoLAⅠα1α2与恒定链结合及在真核细胞共定位

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中国免疫学杂志 2024年第1期40卷 72-77页

作者：陈芳芳于凤梅刘翠艳桂亚萍李锦春安徽农业大学动物科技学院合肥230036

目的:探明牛主要组织相容性复合体(BoLA)Ⅰ类分子α链的多态性和结合恒定链(Ii)的结构域。方法:从3头淮北黄牛获得75条BoLAⅠα基因序列,应用分子生物学软件进行比对分析;克隆典型BoLAⅠα结构域和Ii基因插入原核表达质粒,诱导蛋白表达... 详细信息

目的:探明牛主要组织相容性复合体(BoLA)Ⅰ类分子α链的多态性和结合恒定链(Ii)的结构域。方法:从3头淮北黄牛获得75条BoLAⅠα基因序列,应用分子生物学软件进行比对分析;克隆典型BoLAⅠα结构域和Ii基因插入原核表达质粒,诱导蛋白表达后进行纯化鉴定,用拉下法和免疫印迹检测BoLA Iα链与Ii结合的结构域。构建相应真核重组质粒,应用激光共聚焦显微镜观察其BoLAⅠα片段与Ii在细胞内共定位。结果:首先,所克隆的BoLAⅠα基因序列存在至少5种基因型,呈现高度多态性,分布于该分子的抗原肽结合区域(α1α2)和胞浆区。其次,构建的含BoLAⅠα1α2α3、BoLAⅠα1α2和BoLAⅠα3基因的原核重组质粒经诱导表达和蛋白纯化,其中,BoLAⅠα1α2α3、BoLAⅠα1α2具有结合Ii的活性功能。最后,在293T细胞内BoLAⅠα1α2α3和BoLAⅠα1α2与Ii共定位,而单一BoLAⅠα3却不能。结论:BoLAⅠα基因具有高度多态性,BoLAⅠα1α2是与Ii结合和胞内共定位的功能片段。

关键词： BoLA 高度多态性 Ii 结合共定位

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基于ATAC-seq足迹识别共定位转录因子

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基于ATAC-seq足迹识别共定位转录因子

作者：韩璐内蒙古大学

学位级别：硕士

转录因子通过与顺式调控元件结合参与基因转录的精确调控。哺乳动物的转录因子(TF)多达数千种,每一个转录因子通常不单独发挥作用,而是以一种组合的方式协同作用于DNA顺式调控元件,解析转录因子的协同性有助于深入理解基因的转录调控机... 详细信息

转录因子通过与顺式调控元件结合参与基因转录的精确调控。哺乳动物的转录因子(TF)多达数千种,每一个转录因子通常不单独发挥作用,而是以一种组合的方式协同作用于DNA顺式调控元件,解析转录因子的协同性有助于深入理解基因的转录调控机制。针对人类基因组,本文提出了一个以泊松分布为背景识别转录因子共定位的模型。该模型利用转录因子模体之间的距离识别了同位竞争转录因子对和近邻协同转录因子对,这些转录因子间的竞争或协同具有调控基因表达的作用。首先,利用ENCODE数据库中K562细胞系的ATAC-seq数据,得到ATAC-seq足迹位点数据。然后,应用Regulatory Genomics Toolbox(RGT)软件的analysis-motif工具包在足迹位点进行模体搜索,得到633种TFs模体匹配的位置信息。其次,以TF模体位置数据作为泊松分布模型的输入,计算得到转录因子两两共定位的随机概率值p。最后,根据p值筛选得到极显著共定位的转录因子对。结果显示,同家族内部的转录因子之间呈现竞争结合的现象,例如KLF家族、FOS家族等。对这些极显著共定位转录因子家族的模体进行序列相关性分析,发现同家族的转录因子(如KLF2和KLF6)的模体相关性高达0.966。这一结果证实同家族转录因子结合模体越相似,竞争同一结合位点的可能性越大。我们进一步对ENCODE数据库中另外15个细胞系进行同样的分析,发现在前列腺癌细胞系(PC-3)中存在特异性转录因子BATF。结果表明,在不同细胞系中大部分转录因子以组合的方式调控基因的表达,转录因子结合的模体序列对共定位的组合模式有一定影响,且PC-3细胞系中存在特异性的共定位组合。本研究为深入探究转录因子与DNA相互作用、转录因子调控基因表达的机制提供了理论依据。

关键词：转录因子共定位足迹模体模体距离

家蚕微孢子虫伴侣蛋白CCT亚基共定位与互作研究

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家蚕微孢子虫伴侣蛋白CCT亚基共定位与互作研究

作者：陈颖江苏科技大学

学位级别：硕士

微孢子虫是一类典型的专性细胞内寄生的单细胞真核生物。它可以感染无脊椎和脊椎动物,包括人类。自首次从家蚕中发现家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）距今已有160多年的研究历史。迄今为止,已经发现鉴定了200属的1500种微孢子虫。家蚕... 详细信息

微孢子虫是一类典型的专性细胞内寄生的单细胞真核生物。它可以感染无脊椎和脊椎动物,包括人类。自首次从家蚕中发现家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）距今已有160多年的研究历史。迄今为止,已经发现鉴定了200属的1500种微孢子虫。家蚕微粒子病是一种严重的传染病,通过幼虫食下感染,或经卵传递给子代,对蚕业生产造成严重的经济损失。因此,家蚕微粒子病是养蚕业中唯一的法定检疫对象。微孢子虫的整个生命周期发生在宿主细胞中,其中包括一系列新生肽的合成和折叠。伴侣蛋白CCT八个亚基当作单体时,称为CCTα-CCTθ,当作复合体时,称TRIC,又称TCP-1环状复合体（chaperonin-containing T-complex polypeptide-1）,它可以防止蛋白质错误折叠和聚集。在本研究中,我们通过基因克隆、共定位分析及亚基间相互作用研究,初步确定了CCT复合体亚基的共定位特征以及相关亚基间的相互作用,研究结果有助于全面了解CCT复合体的功能及其在微孢子虫增殖中的作用,对养蚕业防治家蚕微粒子病具有一定的指导意义。本研究我们克隆得到家蚕微孢子虫NbCCTζ基因,生物信息学分析显示,该基因全长1206 bp,编码402个氨基酸,预测分子质量和等电点分别为44 k Da和9.15。NbCCTζ蛋白无信号肽和跨膜结构域,包含α螺旋和无规则卷曲,含有32个磷酸化修饰和2个N-糖基化修饰,没有O-糖基化位点。间接免疫荧光结果显示,在家蚕微孢子虫核分裂过程中,该蛋白分布在细胞质中;NbCCTζ与Nb-actin、Nb-tubulin共定位结果显示,NbCCTζ与Nb-actin、Nb-tubulin均有共定位的特征,聚集在细胞核周围并向外围扩散,推测NbCCTζ蛋白参与actin和tubulin的折叠组装。利用si RNA敲低NbCCTζ基因检测NbCCTζ对Nbssr RNA表达的调控作用,结果显示RNA干扰下调了NbCCTζ基因的转录活性;干扰NbCCTζ后,Nbssr RNA的表达受到抑制,说明NbCCTζ可能在家蚕微孢子虫的增殖过程中起着重要的作用。为了对CCT亚基间功能的初步探究,我们对八个亚基之间进行两两共定位分析,结果显示NbCCTζ与NbCCTα、NbCCTζ与NbCCTη、NbCCTβ与NbCCTδ、NbCCTβ与NbCCTθ均有共定位的特征。有的亚基之间是完全重叠,有的是分布不均匀,研究结果表明CCT复合体发挥作用时,所有的亚基不一定全部参与。进一步对CCT亚基之间的互作调控机制进行探究,成功地构建出NbCCTζ-p GADT7与NbCCTα-p GBKT7重组质粒,并用酵母双杂交验证了NbCCTζ与NbCCTα有相互作用。RNAi结果显示干扰NbCCTα后,NbCCTζ在4个时间点的相对表达量均下调;干扰NbCCTζ后,NbCCTα的相对表达量在一个时间点上调,其他三个时间点下调。我们推测在家蚕微孢子虫感染增殖时期,CCT复合体帮助蛋白质折叠过程中NbCCTζ与NbCCTα之间具有协同调控关系。

关键词：家蚕微孢子虫 CCT 共定位 RNAi 蛋白质互作

利用蛋白质支架共定位关键途径酶增强大肠杆菌产香叶醇的研究

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利用蛋白质支架共定位关键途径酶增强大肠杆菌产香叶醇的研究

作者：肖龙杰南京林业大学

学位级别：硕士

香叶醇在食品、医药、化妆品、能源等领域有着广泛的应用,具有巨大的市场潜力。从植物中提取的香叶醇受限于原料供应的问题,而化学合成也面临高能耗和污染环境等问题,利用微生物生物合成香叶醇成为一种环境友好型的替代方法,具有很大的... 详细信息

香叶醇在食品、医药、化妆品、能源等领域有着广泛的应用,具有巨大的市场潜力。从植物中提取的香叶醇受限于原料供应的问题,而化学合成也面临高能耗和污染环境等问题,利用微生物生物合成香叶醇成为一种环境友好型的替代方法,具有很大的发展潜力。然而,基于微生物合成的香叶醇生产距离商业化应用仍有巨大差距,主要原因是香叶醇合成途径中的代谢中间体对宿主细胞产生毒性,阻碍了香叶醇产量的进一步提高。蛋白支架系统是用于调控代谢通量,影响代谢中间体的最新策略。利用蛋白支架共定位途径关键酶,在空间使级联酶靠近,具有以下几点优势:增加底物、酶和反应中间体浓度,为酶提供更适合的微环境;使代谢通路酶高度集中减少反应竞争损失;同时也减少副反应的发生,使产品更加纯净;减缓反应中间体对宿主细胞产生的毒性问题,有效提高代谢物转化率。本论文对大肠杆菌生物合成香叶醇的代谢途径进行研究,通过引入蛋白支架共定位香叶醇合成的关键途径酶,使代谢酶靠近从而加速级联反应,最终减少代谢中间体对宿主细胞的毒性影响。主要研究结果如下:(1)构建不同配体蛋白分别与三种途径酶连接的质粒。在大肠杆菌中表达包含所构建质粒的重组菌株,通过香叶醇产量的变化反映不同配体蛋白对途径酶的影响,从而筛选出最佳的配体蛋白分配方案。配体蛋白与途径酶通过linker连接子直接融合,通过培养对比,最终选择的配体蛋白分配方案为:IDI-SH3lig、GES-Ccdockerin和GPPS-Ctdockerin。这三种配体蛋白在重组菌株中的同时表达实现了597.2 mg/L的香叶醇产量,对比未连接配体蛋白的重组菌株(521 mg/L)提高了14.6%。(2)构建表达支架蛋白的质粒,并在培养表达后将蛋白纯化出来用于验证配体蛋白和支架蛋白的结合效果。支架蛋白中的结合域通过linker连接,同时在蛋白的C端连接组氨酸标签用于镍柱纯化。通过体外免疫沉淀下拉实验验证配体蛋白与支架蛋白间的相互作用。结果显示,支架SH3-Ct Cohesin-Cc Cohesin(STC)和配体蛋白(IDI-SH3lig、GES-Ccdockerin和GPPS-Ctdockerin)在胞外发生了明显的蛋白质-蛋白质相互作用,能形成相关复合物。(3)支架体系由重组菌株WS表达,对照样由重组菌株NS表达,通过对培养过程的监测对比共定位途径酶的效果。结果显示重组菌株WS在培养第一天更快的生产了更多的香叶醇,但是后续香叶醇产量降低,最终香叶醇产量少于重组菌株NS。这是由于支架表达与香叶醇生产竞争底物,甘油的缺少导致最终产量的降低。通过在培养过程中补充底物也验证了这一结论,最终重组菌株WS的香叶醇摇瓶产量达到677.1 mg/L,略高于重组菌株NS的香叶醇摇瓶产量(641 mg/L)。(4)对重组菌株WS生产香叶醇的培养条件(培养温度、初始甘油含量、诱导起始浓度,诱导剂浓度)进行优化。结果表明支架结构的最佳的培养条件是在初始甘油浓度为30 g/L的培养基中,在25°C的摇瓶中培养,初始细胞浓度OD为1.5时加入0.5m M的诱导剂。在最佳条件下培养24 h产生777.8 mg/L的香叶醇,比优化前的341.2mg/L增加了2.2倍。为进一步提高香叶醇产量,对重组菌株WS和NS同时进行分批补料发酵,重组菌株WS最优条件下香叶醇产量在112 h达到2102.5 mg/L,而重组菌株NS最优条件下香叶醇产量为1460.6 mg/L,由此显示,支架共定位系统对比游离系统的香叶醇产量增加了42.9%。

关键词：香叶醇大肠杆菌途径酶蛋白支架共定位

玉米根细胞中类整合素蛋白与α-微管蛋白的共定位及其可能的相互作用(英文)

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植物生理与分子生物学学报 2007年第2期33卷 115-122页

作者：吕冰陈枫龚忠华梁建生扬州大学生物科学与技术学院江苏省作物遗传与生理重点实验室扬州225009

采用间接免疫荧光标记法对玉米根细胞中的类整合素蛋白和细胞骨架主要组分之一的α-微管蛋白进行了荧光定位。结果表明:类整合素蛋白主要分布在质膜上。与对照相比,用与类整合素蛋白特异结合的5肽GRGDS处理后,质膜上类整合素的分布更为... 详细信息

采用间接免疫荧光标记法对玉米根细胞中的类整合素蛋白和细胞骨架主要组分之一的α-微管蛋白进行了荧光定位。结果表明:类整合素蛋白主要分布在质膜上。与对照相比,用与类整合素蛋白特异结合的5肽GRGDS处理后,质膜上类整合素的分布更为均匀,微管的排列密度降低,而用不与类整合素蛋白特异结合的GRGDS类似物SDGRG处理则对类整合素蛋白分布和微管蛋白的排列均无明显影响。微管蛋白解聚剂或稳定剂处理改变类整合素在质膜上的分布。这些结果表明类整合素蛋白与微管蛋白间有复杂的相互作用。

关键词：共定位间接免疫荧光类整合素蛋白相互作用 α-微管蛋白玉米

猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析

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微生物学报 2011年第5期51卷 643-647页

作者：吕茂杰陈建飞时洪艳陈小金范秀萍申识川冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

【目的】阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白与病毒感染细胞核仁成分B23.1蛋白的共定位特征。【方法】分别参照GenBank中PEDV CV777株的N基因序列(AF353511)和编码人细胞核仁蛋白B23.1基因序列(BC050628.1),设计、合成扩增N基因和B2... 详细信息

【目的】阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白与病毒感染细胞核仁成分B23.1蛋白的共定位特征。【方法】分别参照GenBank中PEDV CV777株的N基因序列(AF353511)和编码人细胞核仁蛋白B23.1基因序列(BC050628.1),设计、合成扩增N基因和B23.1基因的引物,利用RT-PCR技术扩增了N基因和Vero E6细胞的B23.1基因的cDNA,分别克隆到真核表达载体pAcGFP1-C1和pDsRed2-N1,获得重组质粒pAcGFP1-C1/N和pDsRed2-N1/B23.1,共转染Vero E6细胞。【结果】Western blots分析表明这些融合蛋白在转染的Vero E6细胞中表达;共聚焦显微镜技术分析表明在共转染Vero E6细胞中猪流行性腹泻病毒N蛋白与Vero E6细胞核磷蛋白B23.1发生共定位。【结论】为进一步鉴定PEDV N蛋白中核仁定位信号和N蛋白核仁定位机制提供可靠依据。

关键词：猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白核磷蛋白B23.1 共定位

TRIM22与HIV衣壳蛋白p24在脑胶质瘤细胞中的表达特点及共定位研究

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西安交通大学学报（医学版） 2019年第3期40卷 382-386页

作者：安新业纪冰孙大康滨州医学院附属医院检验科山东滨州256603 滨州医学院附属医院临床医学实验室山东滨州256603

目的观察外源性三基序蛋白22(TRIM22)与HIV衣壳蛋白p24在U-251脑胶质瘤细胞中的表达特点及共定位情况。方法分别将pEGFP-N3-TRIM22或pDsRed1p24载体转染U-251细胞,通过激光共聚焦显微镜观察TRIM22-EGFP和p24-DsRed1的表达和分布情况。... 详细信息

目的观察外源性三基序蛋白22(TRIM22)与HIV衣壳蛋白p24在U-251脑胶质瘤细胞中的表达特点及共定位情况。方法分别将pEGFP-N3-TRIM22或pDsRed1p24载体转染U-251细胞,通过激光共聚焦显微镜观察TRIM22-EGFP和p24-DsRed1的表达和分布情况。通过激光共聚焦xyz轴扫描,经ImageJ 1.50i软件进行3D结构重建,观察p24-Dsred1在U-251细胞中的分布特点。将pEGFP-N3-TRIM22和pDsRed1p24载体在U-251细胞中共表达,观察TRIM22-EGFP和p24-DsRed1是否存在共定位关系。结果单独转染pEGFP-N3-TRIM22或pDsRed1p24载体时,TRIM22-EGFP和p24-DsRed1在U-251细胞的胞体或突起中均有较高水平的表达;且3D结构重建显示外源性p24-DsRed1可迁移至U-251细胞的足突。在U-251细胞共转染pEGFP-N3-TRIM22和pDsRed1p24载体时,TRIM22-EGFP与p24-DsRed1存在共定位关系,并能以出胞形式脱离细胞。结论 TRIM22与HIV衣壳蛋白p24在U-251脑胶质瘤细胞中存在共定位关系。

关键词： HIV 衣壳蛋白p24 三基序蛋白22 共定位脑胶质瘤细胞

大豆全基因组分枝相关基因发掘及与QTL共定位

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遗传 2013年第6期35卷 793-804页

作者：谭冰郭勇邱丽娟东北农业大学大豆研究所哈尔滨150030 中国农业科学院作物科学研究所国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程北京100081

大豆(Glycine max)分枝在个体和群体水平上均与大豆产量关系密切,因此大豆分枝相关基因的发掘及利用对大豆高产分子育种具有重要意义。文章通过GO(Gene ontology)分类和文献检索共获得植物分枝发育相关基因183个。基于序列相似和结构域... 详细信息

大豆(Glycine max)分枝在个体和群体水平上均与大豆产量关系密切,因此大豆分枝相关基因的发掘及利用对大豆高产分子育种具有重要意义。文章通过GO(Gene ontology)分类和文献检索共获得植物分枝发育相关基因183个。基于序列相似和结构域相同的原则,从大豆基因组中发掘出大豆分枝相关的候选基因406个。通过收集已发表的大豆分枝相关QTL,利用BioMercator2.1软件,将符合映射条件的35个QTL映射到公共图谱的12个染色体。通过共定位分析发现,在20个分枝相关的QTL区间内存在大豆分枝相关候选基因57个。本文发掘的分枝发育相关基因信息为大豆分枝相关QTL的精细定位和克隆以及大豆分枝发育的分子生物学基础研究提供了参考。

关键词：大豆分枝基因 QTL 共定位

HIV衣壳蛋白P24与TRIM22在HEK293T细胞中的表达及共定位

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细胞与分子免疫学杂志 2015年第8期31卷 1081-1084页

作者：孙大康安新业周玉明纪兵宋向芹徐殿红滨州医学院附属医院临床医学实验中心山东滨州256603 滨州医学院附属医院检验科山东滨州256603 滨州医学院烟台附属医院检验科山东烟台264100

目的观察人类免疫缺陷病毒(HIV)衣壳蛋白P24与三基序蛋白22(TRIM22)在HEK293T细胞中的共定位情况。方法以慢病毒载体p LP1为模板,通过PCR法扩增p24编码序列,克隆至p DsRed-Monomer-N1真核表达载体。经菌落PCR、双酶切及DNA测序进行鉴定... 详细信息

目的观察人类免疫缺陷病毒(HIV)衣壳蛋白P24与三基序蛋白22(TRIM22)在HEK293T细胞中的共定位情况。方法以慢病毒载体p LP1为模板,通过PCR法扩增p24编码序列,克隆至p DsRed-Monomer-N1真核表达载体。经菌落PCR、双酶切及DNA测序进行鉴定。将p DsRed-Monomer-N1-p24与p EGFP-N3-TRIM22载体共同转染HEK293T细胞,用荧光显微镜观察p24-DsRed-Monomer和TRIM22-EGFP的表达及共定位情况。结果经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,成功构建p DsRedMonomer-N1-p24真核表达载体。通过荧光显微镜检测发现,p24-DsRed-Monomer和TRIM22-EGFP在HEK293T细胞中存在共定位关系。结论 HIV衣壳蛋白P24与TRIM22存在共定位。

关键词：人类免疫缺陷病毒衣壳蛋白 P24 TRIM22 共定位