利用蛋白质支架共定位关键途径酶增强大肠杆菌产香叶醇的研究

作     者：肖龙杰 

作者单位：南京林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李迅

授予年度：2023年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：香叶醇 大肠杆菌 途径酶 蛋白支架 共定位 

摘      要：香叶醇在食品、医药、化妆品、能源等领域有着广泛的应用,具有巨大的市场潜力。从植物中提取的香叶醇受限于原料供应的问题,而化学合成也面临高能耗和污染环境等问题,利用微生物生物合成香叶醇成为一种环境友好型的替代方法,具有很大的发展潜力。然而,基于微生物合成的香叶醇生产距离商业化应用仍有巨大差距,主要原因是香叶醇合成途径中的代谢中间体对宿主细胞产生毒性,阻碍了香叶醇产量的进一步提高。蛋白支架系统是用于调控代谢通量,影响代谢中间体的最新策略。利用蛋白支架共定位途径关键酶,在空间使级联酶靠近,具有以下几点优势:增加底物、酶和反应中间体浓度,为酶提供更适合的微环境;使代谢通路酶高度集中减少反应竞争损失;同时也减少副反应的发生,使产品更加纯净;减缓反应中间体对宿主细胞产生的毒性问题,有效提高代谢物转化率。本论文对大肠杆菌生物合成香叶醇的代谢途径进行研究,通过引入蛋白支架共定位香叶醇合成的关键途径酶,使代谢酶靠近从而加速级联反应,最终减少代谢中间体对宿主细胞的毒性影响。主要研究结果如下:(1)构建不同配体蛋白分别与三种途径酶连接的质粒。在大肠杆菌中表达包含所构建质粒的重组菌株,通过香叶醇产量的变化反映不同配体蛋白对途径酶的影响,从而筛选出最佳的配体蛋白分配方案。配体蛋白与途径酶通过linker连接子直接融合,通过培养对比,最终选择的配体蛋白分配方案为:IDI-SH3lig、GES-Ccdockerin和GPPS-Ctdockerin。这三种配体蛋白在重组菌株中的同时表达实现了597.2 mg/L的香叶醇产量,对比未连接配体蛋白的重组菌株(521 mg/L)提高了14.6%。(2)构建表达支架蛋白的质粒,并在培养表达后将蛋白纯化出来用于验证配体蛋白和支架蛋白的结合效果。支架蛋白中的结合域通过linker连接,同时在蛋白的C端连接组氨酸标签用于镍柱纯化。通过体外免疫沉淀下拉实验验证配体蛋白与支架蛋白间的相互作用。结果显示,支架SH3-Ct Cohesin-Cc Cohesin(STC)和配体蛋白(IDI-SH3lig、GES-Ccdockerin和GPPS-Ctdockerin)在胞外发生了明显的蛋白质-蛋白质相互作用,能形成相关复合物。(3)支架体系由重组菌株WS表达,对照样由重组菌株NS表达,通过对培养过程的监测对比共定位途径酶的效果。结果显示重组菌株WS在培养第一天更快的生产了更多的香叶醇,但是后续香叶醇产量降低,最终香叶醇产量少于重组菌株NS。这是由于支架表达与香叶醇生产竞争底物,甘油的缺少导致最终产量的降低。通过在培养过程中补充底物也验证了这一结论,最终重组菌株WS的香叶醇摇瓶产量达到677.1 mg/L,略高于重组菌株NS的香叶醇摇瓶产量(641 mg/L)。(4)对重组菌株WS生产香叶醇的培养条件(培养温度、初始甘油含量、诱导起始浓度,诱导剂浓度)进行优化。结果表明支架结构的最佳的培养条件是在初始甘油浓度为30 g/L的培养基中,在25°C的摇瓶中培养,初始细胞浓度OD为1.5时加入0.5m M的诱导剂。在最佳条件下培养24 h产生777.8 mg/L的香叶醇,比优化前的341.2mg/L增加了2.2倍。为进一步提高香叶醇产量,对重组菌株WS和NS同时进行分批补料发酵,重组菌株WS最优条件下香叶醇产量在112 h达到2102.5 mg/L,而重组菌株NS最优条件下香叶醇产量为1460.6 mg/L,由此显示,支架共定位系统对比游离系统的香叶醇产量增加了42.9%。