融合蛋白药物IFNα-ELP（V）在宫颈癌中的临床研究

作     者：李宜霖 

作者单位：潍坊医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：王永军

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：宫颈癌 化疗 融合蛋白 干扰素 类弹性蛋白多肽 环境响应性 

摘      要：目的:研究通过构建、表达和纯化融合蛋白IFNɑ-ELP(V),探讨IFNɑ-ELP(V)的理化性质以及对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响。方法:(1)融合蛋白药物IFNɑ-ELP(V)的表达纯化与理化特性验证:首先将构建好的IFNɑ-ELP(V)质粒转入大肠杆菌(E.coil)进行蛋白表达;通过可逆相变循环(ITC)方法纯化蛋白并用凝胶电泳(SDS-PAGE)验证其分子量;通过水浴锅升降温验证其温度响应性特征;通过浊度法(350nm OD)测量可逆性相转变的性质。(2)IFNɑ-ELP(V)对宫颈癌细胞的体外研究:选用宫颈鳞状细胞癌Hela和宫颈腺癌Si Ha细胞系;将实验分为6组:PBS组、IFNɑ-ELP(V)组、顺铂组、IFNɑ组,IFNɑ+顺铂组以及IFNɑ-ELP(V)+顺铂组,采用CCK8和Annexin V-FITC/PI实验检测各治疗组对宫颈癌Hela细胞和Si Ha细胞的体外抗增殖活性和细胞凋亡的影响;通过FITC荧光标记蛋白IFNɑ和IFNɑ-ELP(V),并使用共聚焦显微镜和流式细胞仪检测宫颈癌细胞的摄取能力。(3)IFNɑ-ELP(V)抗肿瘤效应的动物实验研究:构建宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,将实验动物分为6组:PBS组、IFNɑ-ELP(V)组、顺铂组、IFNɑ组,IFNɑ+顺铂组以及IFNɑ-ELP(V)+顺铂组,待肿瘤体积生长至50mm,分别进行药物注射,评估肿瘤大小的变化并观察小鼠的存活率。结果:(1)通过蛋白表达和纯化成功获取IFNɑ-ELP(V)融合蛋白,SDS-PAGE结果表明成功表达和纯化IFNɑ(20KD)和IFNɑ-ELP(V)(57KD)蛋白,浊度法实验结果表明IFNɑ-ELP(V)的可逆相转变行为。(2)宫颈癌细胞水平实验结果:CCK8结果表明,IFNɑ-ELP(V)组随着药物浓度的增加(100ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml),细胞相对活力逐渐降低(71.4%、43.2%、32.5%),表明其抗宫颈癌细胞增殖的作用;细胞凋亡结果表明,与对照PBS组(凋亡率:4.98%)相比,IFNɑ-ELP(V)组(凋亡率:7.83%)具有促进宫颈癌细胞凋亡的作用(P0.05);与顺铂组(凋亡率:13.75%)和IFNɑ-ELP(V)(凋亡率:7.83%)单药组相比,IFNɑ-ELP(V)联合顺铂组的细胞凋亡率最高,达27.78%(P0.05),表明二者的协同促凋亡效应。(3)体内动物水平抗肿瘤结果:相比于其它治疗组(PBS组:1031.4mm;IFNα组:691.2 mm;IFNɑ-ELP(V)组:455.2 mm;顺铂组:437.1 mm;IFNα联合DDP组:379.02mm),IFNɑ-ELP(V)联合顺铂组的肿瘤生长最慢,平均体积最小(46.5mm)(P0.05);生存期显著延长(中位生存时间:54天)。结论:(1)本研究成功构建、表达和纯化了融合蛋白药物IFNɑ-ELP(V);IFNɑ-ELP(V)可原位形成药物储库,具有缓慢释放的功能。(2)IFNɑ-ELP(V)可以抑制宫颈癌细胞的增殖、促进宫颈癌细胞的凋亡,并与顺铂联用产生协同效应,显著延长小鼠的生存时间。