流体剪切力促进成骨细胞增殖过程中miR-199a-3p的作用机制研究

作     者：王力夫 

作者单位：兰州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：夏亚一

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：流体剪切力 miR-199a-3p 成骨细胞 增殖 CABLES-1/ik-3 

摘      要：目的:研究miR-199a-3p是否参与流体剪切力(Fluid shear stress,FSS)调控成骨细胞增殖的过程及其可能的分子机制。方法:对成骨细胞MC3T3-E1加载不同时间的FSS,通过CCK-8实验检测细胞增殖活性,寻找FSS促进成骨细胞增殖的最佳条件。在最佳FSS条件下,检测FSS对miR-199a-3p表达的影响。为了探究miR-199a-3p对成骨细胞MC3T3-E1的作用,将miR-199a-3p mimic、miR-199a-3p inhibitor分别转染MC3T3-E1细胞,使用CCK-8实验检测细胞增殖活性,使用Western blot技术与q RT-PCR技术检测CDK6、Cyclin D1、PCNA的蛋白表达量与m RNA表达量。设置FSS+miR-199a-3p mimic组探究miR-199a-3p对FSS介导的成骨细胞增殖的作用,使用CCK-8实验法检测细胞增殖活性,使用Western blot检测增殖相关蛋白CDK6、Cyclin D1、PCNA的表达。为了进一步探索miR-199a-3p与CABLES-1/ik-3的关系,上调和下调miR-199a-3p后通过Western blot检测CABLES-1/ik-3的蛋白表达量,并在此基础上通过双荧光素酶实验检测miR-199a-3p与CABLES-1/ik-3的关系。使用CABLES-1/ik-3 si RNA,CABLES-1/ik-3 pc DNA分别转染MC3T3-E1细胞,过表达和敲减CABLES-1/ik-3基因,通过q RT-PCR和Western blot检测PCNA、CDK6、Cyclin D1的表达,CCK-8检测细胞增殖活性。设置miR-199a-3p mimic+CABLES-1/ik-3 pc DNA共转染组与CABLES-1/ik-3 si RNA+miR-199a-3p inhibitor共转染组,通过CCK-8实验检测细胞增殖活性,Western blot实验检测增殖相关蛋白表达。结果:在45 min、12 dy/cm大小的FSS作用下,MC3T3-E1成骨细胞增殖活性最强(p0.05)同时miR-199a-3p表达出现下调(p0.05)。miR-199a-3p mimic可以抑制成骨细胞增殖以及相关增殖蛋白的表达(p0.05);miR-199a-3p inhibitor可以促进成骨细胞增殖以及相关增殖蛋白的表达(p0.05)。miR-199a-3p mimic可以逆转FSS介导的成骨细胞增殖作用(p0.05)。过表达与敲减miR-199a-3p后CABLES-1/ik-3蛋白的变化(p0.05)以及双荧光素酶实验结果(p0.05)提示miR-199a-3p通过直接作用于靶基因CABLES-1/ik-3。过表达的miR-199a-3p可以逆转FSS对CABLES-1/ik-3的上调作用(p0.05)。过表达CABLES-1/ik-3可以逆转miR-199a-3p mimic诱导的抑制成骨细胞增殖作用(p0.05);敲减CABLES-1/ik-3可以逆转miR-199a-3p inhibitor诱导的成骨细胞增殖作用(p0.05)。结论:FSS诱导miR-199a-3p下调通过激活CABLES-1/ik-3促进成骨细胞增殖。