家蚕BmCdk5和BmP35基因克隆及作用探究

作     者：张荣成 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈萍

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 090501[农学-动物遗传育种与繁殖] 

主      题：家蚕 BmCdk5 BmP35 克隆 功能 

摘      要：细胞周期依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinases,Cdks）是真核生物进行细胞周期调控的中心组件。Cdk5属于Cdks家族成员,分布于多种组织中,通过磷酸化不同底物在神经活动、生殖以及运动等生物学功能中发挥重要作用,临床上也与阿尔兹海默症、肥胖以及药物成瘾等疾病相关。P35是Cdk5的特异性激活因子,含有Cdk5＿activator结构域,能够与Cdk5结合并激活Cdk5,进而磷酸化下游底物,从而在多种生物学过程中发挥作用。家蚕是我国传统的经济昆虫,也是重要的鳞翅目模式生物,迄今没有Cdk5和P35在家蚕中功能研究的报道。本文通过q RTPCR、基因过表达以及酶活测定等手段,结合体内分析和体外实验,对家蚕BmCdk5和BmP35基因在雌性生殖以及作用机制上进行了初步探究,结果如下:1.家蚕BmCdk5和Bmp35基因的生物信息学分析同源比对显示,家蚕基因组中仅存在1个BmCdk5基因和1个BmP35基因,BmCdk5位于chr19:8889293-8894316（-）,BmP35基因位于chr3:3436505-3437431（-）。BmCdk5蛋白预测显示有1个Cdk5特征结构域（丝氨酸/苏氨酸激酶激活结构域）,分子量33.8 KD,等电点7.61,无信号肽,亲水性较好。BmP35蛋白预测显示有1个Cdk5结合结构域,具有跨膜结构,分子量26.8 KD,等电点10.3,无信号肽,亲水性好。亚细胞定位预测BmCdk5蛋白主要存在于细胞质和细胞核中;BmP35蛋白广泛存在于细胞膜、细胞质、细胞核以及细胞外基质。2.家蚕BmCdk5和BmP35基因克隆及表达分析用5龄3天头部c DNA做模板,克隆分别获得了BmCdk5的ORF序列长度为897bp,BmP35的ORF序列长度为678bp。头、表皮、脂肪体、马氏管、血液、精巢、卵巢、中肠、丝腺9个组织的表达分析显示,BmCdk5在脂肪体、头和表皮等表达较高,在中肠、精巢、卵巢和血液有一定量表达,在马氏管和丝腺表达很低。BmP35也是在头和表皮中高量表达,在中肠和血液有一定量表达,但在精巢、卵巢和脂肪体中的表达与BmCdk5有所不同相同。将BmCdk5基因与p ET-28a（+）载体重组,成功构建BmCdk5的原核表达载体,经不同条件诱导培养,获得目的基因蛋白大量出现在包涵体,Ni柱咪唑洗脱纯化,为抗体制备做准备。***5、BmP35在家蚕雌蛾不同生殖部位及阶段的表达特征皓月品种产卵正常,但皓月sch品种产卵速度慢、产卵量少、产出卵中不受精卵率高。通过在羽化、羽化后1 h、交配3 h、拆对后2 h、拆对后4 h、拆对后8 h等6个不同生殖行为时期雌性生殖器官中BmCdk5和BmP35的表达变化进行研究,发现BmCdk5在卵巢管和输卵管中的表达变化趋势在两个品种间比较一致,表达量出现高峰时期在两个品种间略有差异;随生殖阶段不同,BmCdk5在产卵器和黏液腺中表达变化趋势有很大差异,如皓月产卵器中各个时期BmCdk5表达量相差不大,但皓月sch产卵器中BmCdk5的表达量在产卵4 h时陡然开始升高。两个品种间,BmP35在卵巢管和输卵管中的表达变化趋势比较一致,差异仅出现产卵行为的中后期;在生殖行为的早期,BmP35在产卵器和黏液腺中的表达有很大差异。BmP35的表达变化与BmCdk5有些相似,由此推测BmCdk5和BmP35在产卵器和黏液腺中异常表达可能与皓月sch品种产卵差的表型有关。***5、BmP35基因与BmDop2r2基因的相互关系分析合成BmDop2r2的ds RNA,以EGFP为对照,注射雌蛹,结果发现降低BmDop2r2表达后,BmCdk5和BmP35基因的表达量显著上调。推测BmCdk5和BmP35可能位于BmDop2r2上游,对BmDop2r2有调控作用。利用Eco RⅠ和XhoⅠ位点构建了Pizv5-BmCdk5（ORF全长）过表达载体,利用Eco RⅠ和XhoⅠ位点构建了Pizv5-BmP35（ORF全长）过表达载体,分别转染家蚕卵巢细胞系。ELISA分析显示,过表达BmCdk5,胞内c AMP水平无明显变化;过表达BmP35,胞内c AMP水平明显升高。这个可能是Cdk5的激活活化要求结合因子P35所致。结合磷酸化位点预测,BmDop2r2有7个潜在的可被磷酸化的位点,暗示BmP35通过与BmCdk5结合磷酸化BmDop2r2,改变胞内c AMP水平。***5对BmDop2r2的磷酸化修饰分析Phosbind Acrylamide能够结合磷酸基团,降低被结合蛋白的迁移率,由此能通过电泳观察蛋白是否被磷酸化。利用AscⅠ单酶切将带有mcherry红色荧光的过表达载体与BmDop2r2通过无缝克隆技术成