不同膳食脂肪酸通过TLR4/NF-κB信号通路调控NLRP3炎性小体影响软骨细胞焦亡的体外实验研究

作     者：金鑫 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘莉

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：脂肪酸 骨关节炎 TLR4/NF-κB NLRP3 焦亡 

摘      要：目的:骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是当今最常见的慢性疾病之一,关节创伤、年龄增长、代谢紊乱、肥胖均可引发OA。近年来肥胖相关OA的发病日趋增多。脂肪酸(Fatty acid,FA)的含量和类型对肥胖相关OA具有不同的影响,但这些差异背后的机制尚不完全清楚。TLR4/NF-κB信号激活的炎症途径以及NLRP3/caspase-1/GSDMD信号诱导的细胞焦亡(Pyroptosis)在OA的发生发展中发挥重要作用。本研究通过观察不同膳食FA对LPS诱导的OA软骨细胞的影响及其机制是否涉及TLR4/NF-κB以及NLRP3/caspase-1/GSDMD信号途径,为阐明不同膳食FA影响OA的作用机制及寻找潜在的治疗靶点提供实验依据。方法:采用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导SW1353软骨肉瘤细胞体外模拟OA状态,CCK-8法检测不同浓度FA和LPS对SW1353细胞活力的影响;Western blot法检测不同浓度FA对SW1353细胞II型胶原、TLR4/NF-κB和NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路蛋白表达水平的影响;给予TLR4抑制剂或转染TLR4过表达慢病毒,Western blot及免疫荧光检测II型胶原、TLR4/NF-κB、IL-1β和NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路相关蛋白表达。结果:1、LPS浓度在0～1000 ng/m L时对SW1353软骨细胞增殖活力无明显影响,当LPS浓度为1000 ng/m L时显著降低Ⅱ型胶原蛋白表达水平(P0.01)。2、PA、OLA、LA和DHA浓度在0～25μM时对SW1353软骨细胞增殖活力均无明显影响。当PA浓度达到50μM、LA浓度达到100μM、OLA和DHA浓度达到200μM时可显著降低细胞增殖活力(P0.01)。3、FA浓度在25μM时,PA和LA会显著降低Ⅱ型胶原表达,增加TLR4、pNF-κB、NLRP3、caspase-1、GSDMD的表达;并进一步增强LPS的炎症作用(P0.05,P0.01);而OLA和DHA处理的细胞II型胶原显著增加,TLR4、p-NF-κB、NLRP3、caspase-1、GSDMD显著降低,并能够逆转LPS诱导的上述蛋白的变化(P0.05,P0.01)。4、使用TLR4抑制剂后,细胞II型胶原表达显著增加,TLR4、p-NF-κB、NLRP3、caspase-1、GSDMD及IL-1β蛋白表达显著下降(P0.05,P0.01);并且逆转了PA及LA引起的II型胶原的降低,抑制了p-NF-κB、NLRP3、caspase-1、GSDMD及IL-1β蛋白表达上调;caspase-1和GSDMD免疫荧光结果也显示同样的作用(P0.05,P0.01)。5、与CON和NC组相比,30 MOI TLR4慢病毒转染细胞后TLR4 m RNA表达水平明显上升(P0.01)。转染30 MOI TLR4过表达慢病毒后,细胞II型胶原表达显著降低,TLR4、NF-κB、NLRP3、caspase-1、GSDMD及IL-1β蛋白表达显著升高(P0.05,P0.01);相比NC组,转染TLR4过表达载体组的软骨细胞在给予OLA或DHA处理后上述蛋白的表达增加;免疫荧光结果与其一致(P0.05,P0.01)。结论:1、SFA、n-6 PUFA为促炎脂肪酸,可促进软骨细胞OA进展;MUFA和n-3PUFA是抗炎脂肪酸,对OA起抑制作用。2、在软骨细胞中,SFA、n-6 PUFA可能通过激活TLR4/NF-κB信号通路,进而激活NLRP3/caspase-1/GSDMD途径介导细胞焦亡,促进炎症;而MUFA和n-3 PUFA可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路,进而抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD途径减少细胞焦亡,抑制炎症。