红花Dof家族生物信息学分析及CtDof2基因的功能鉴定

作     者：贾昶 

作者单位：吉林农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨晶

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：红花 转录因子 Dof 脂肪酸 油脂合成 

摘      要：红花作为一种新型的油料作物,近年来成为人们研究的热点。红花籽油中富含丰富的不饱和脂肪酸,因此红花籽油在食品、医药和工业方面被广泛应用。尤其在替代能源的开发方面,红花籽油作为极具潜力的石油替代能源之一,具有广发开发的应用前景。Dof转录因子是植物特有的一类蛋白。Dof家族成员在植物生长发育和生理过程中发挥重要作用,越来越多的研究表明Dof转录因子参与调控植物种子油脂合成,但是关于红花Dof转录因子的基因信息及功能没有报道。基于本课题组红花基因组数据库我们筛选并鉴定了红花Dof家族成员,分析了红花Dof家族基因的时空特异性表达模式,筛选出与种子发育和油脂积累高度相关的CtDof2基因。构建了酵母表达载体,转化毕赤酵母X33细胞,分析了CtDof2基因对酵母油脂和脂肪酸组分的影响;构建植物表达载体,获得稳定的T3代过表达拟南芥和突变体回补种子,明确CtDof2基因在拟南芥中的功能。研究结果如下:1、基于红花基因组数据库筛选得到33个红花Dof基因,命名为CtDof1-CtDof33。依照系统进化分析将红花Dof基因家族分为6个亚族(A、B、C、D、E和F),其中分子量最大为46.07 k Da,最小为17.39 k Da;所有CtDof的GRAVY值均为负值,表明CtDof家族蛋白为亲水性蛋白;保守基序分析发现了11个Motif,Motif1为Dof保守结构域;24个CtDof基因被共同注释到MF、CC和BP三个过程中;启动子预测结果显示,CtDof基因启动子存在光响应、激素响应、低温胁迫以及种子特异性、胚乳特异性表达的作用元件。2、实时荧光定量结果表明,CtDof24在花和根中高度表达,CtDof13在叶片中表达水平较高,CtDof2基因在种子中的表达量最高。CtDof2基因在种子不同发育时期表达量先上升再下降。3、通过构建酵母表达载体转化酵母细胞发现,转CtDof2基因酵母的油脂含量升高,脂质体的数量和荧光强度大于野生型酵母和转空载体酵母。脂肪酸含量分析结果显示转基因酵母的油酸含量上升,硬脂酸含量下降。4、利用花粉管通道法侵染野生型拟南芥和突变体拟南芥,经过筛选鉴定获得T3代高表达株系。比较不同株系拟南芥之间的性状发现过表达CtDof2基因拟南芥种子千粒重显著提高,突变体回补株系拟南芥种子千粒重低于野生型拟南芥种子。过表达CtDof2基因拟南芥种子的油脂含量显著提高且C16:0、C18:1和C20:1脂肪酸的含量增加,C18:2、C18:3脂肪酸的含量降低。5、通过对油脂合成途径关键基因的表达分析发现CtDof2基因正调控DGAT1、ACP1、ACC1和SSS1基因的表达水平,负调控FAD3和AGPase-S1基因的表达水平,进而影响脂肪酸的含量。