Bak1调控实验性蛛网膜下腔出血小胶质细胞坏死性凋亡及神经炎症的机制研究

作     者：邱显程 

作者单位：西南医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：江涌

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：蛛网膜下腔出血 坏死性凋亡 小胶质细胞 RIPK1 MLKL Bak1 神经炎症 THBS1 全转录组测序 早期脑损伤 

摘      要：蛛网膜下腔出血主要由颅内动脉破裂引起,占所有出血性卒中的5%。其高死亡率和致残率使治疗变得困难。小胶质细胞为神经系统的先天免疫细胞,在神经系统稳态、免疫监测、炎症反应和损伤修复中起着重要作用。蛛网膜下腔出血后,多种病理生理机制在小胶质细胞中诱导氧化应激,过度炎症和程序性细胞死亡,并加重神经炎症。坏死性凋亡是神经系统疾病中神经炎症的重要调节机制,取决于受体相互作用蛋白3(RIPK3)的激酶活性和随后的假激酶混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)的激活,通常也依赖于受体相互作用蛋白1(RIPK1)激酶活性。Bak1(bcl-2同源拮抗剂杀手蛋白)是bcl-2蛋白家族中的线粒体凋亡效应分子,有报道发现Bak1的活化抑制IAP蛋白促进Caspase-8介导的IL-1β活化,促进并加重炎症反应。内源性凋亡及坏死性凋亡在多种效应分子中存在交叉作用,但其相关分子机制还不清楚。我们设计并实施了这次实验,探究内源性凋亡效应分子Bak1在蛛网膜下腔出血后诱导的坏死性凋亡中的作用和潜在分子机制,为蛛网膜下腔出血坏死性凋亡的调控机制提供新的参考,对蛛网膜下腔出血后的治疗提供新思路。本次研究分为三个部分讨论:1.小鼠蛛网膜下腔出血模型构建及小胶质细胞坏死性凋亡检测目的:通过改良单夹穿刺法建立C57BL/6J(雄性)小鼠蛛网膜下腔出血模型。检测蛛网膜下腔出血后损伤脑组织及小胶质细胞坏死性凋亡的发生情况及相关坏死性凋亡标志蛋白的时间表达模式。评估坏死性凋亡发生后神经功能损伤的情况。方法:蛋白质免疫印迹法(Westen blot,WB)检测RIPK1、RIPK3在小鼠在蛛网膜下腔出血模型中24h,48h,72h的表达情况。小鼠腹腔内注射碘化吡啶(propidium iodide,PI)然后通过组织冰冻切片免疫荧光法(Histoimmunofluorescencem,IF),观察小鼠蛛网膜下腔出血后小胶质细胞与PI共定位情况,并检测坏死性凋亡marker蛋白MLKL在小胶质细胞中的表达情况。采用改良加西亚(Garcia)评分及平衡木(Beam balance)评分,评估小鼠发生蛛网膜下腔出血后神经功能评分改变情况,探索坏死性凋亡的发生与神经功能改变的关系。结果:1.成功建立小鼠SAH模型,SAH Grade评分稳定在12-15分之间,WB结果提示RIPK1蛋白水平在造模后24h升高(P0.05),RIPK3蛋白水平无明显变化。2.组织免疫荧光(Histoimmunofluorescencem,IF)提示,坏死性凋亡功能执行蛋白假激酶混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)的的表达在全脑水平升高,并在IBA1+小胶质细胞中发现共定位。3.冰冻切片IF染色中,发现在出血损伤区周围脑组织内细胞PI染色阳性,而Sham组却没有发生这种情况,同时能发现IBA1+小胶质细胞能与碘化吡啶(PI)存在共定位,改良加西亚(Garcia)评分和平衡木(Beam balance)评分在造模后明显下降(P0.05)。结论:小鼠蛛网膜下腔出血后,出血损伤周围组织坏死性凋亡相关标志蛋白表达升高,并且发生组织坏死,提示SAH后诱导坏死性凋亡的发生,并降低小鼠神经功能评分,损伤神经功能。MLKL能共定位到小胶质细胞上,提示小胶质细胞的发生死性凋亡。2.Bak1调控小胶质细胞坏死性凋亡及神经炎症的机制探究。1.目的:坏死性凋亡为细胞坏死的一种亚型可促进细胞死亡并表现为促炎过程,但其下游调控机制不清。Bak1定位于线粒体外膜并产生通透性,在MPTP依赖的细胞坏死性凋亡中起重要作用。Bak1是否调控蛛网膜下腔出血小胶质细胞坏死性凋亡和其促炎反应目前还不清楚。我们应用相关实验及转录组测序探索Bak1调控氧合血红蛋白刺激后小胶质细胞坏死性凋亡和神经炎症的潜在机制,为进一步明确坏死性凋亡相关调控网络和炎症调控机制提供新的视角。2.方法:应用氧合血红蛋白10μM(Oxy-Hb)刺激BV2小胶质细胞系,通过蛋白质免疫印迹法(Westen blot,WB)检测相关坏死性凋亡marker蛋白RIPK1、RIPK3、P-MLKL表达情况。碘化吡啶(propidium iodide,PI)染色明确小胶质细胞发生坏死。DCFH-DA活性氧探针染色观察BV2细胞氧化应激情况。CCK-8检测小胶质细胞活性。细胞内ATP测定评估线粒体状态。RT-q PCR检测小胶质细胞刺激后促炎因子(IL-6,IL-1β,TNFα),促炎表型基因(Irg-1,Gpr84),抗炎基因(Arg-1,Mrc-1),趋化因子(Ccl2,Ccl5,Cxcl2),趋化因子受体(Ccr5),一氧化氮合酶(Nos2)的转录情况,同时检测在z VAD-FMK(Caspase Inhibitor z VADFMK)诱导坏死性凋亡后,小胶质细胞促炎因子(IL-6,IL-1β,TNFα)的改变。免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)明确RIPK1/RIPK3/Bak1蛋白互作情况,并构建Bak1蛋白敲减、敲除细胞株。CCK8,DCFH-DA探针,RT-q PCR,ELIAS,PI染色及坏死性凋亡Marker蛋白检测观察Bak1-KO对小胶质细胞的影响。通过RNA-Seq及后续GSEA富集分析得到Bak1参与调控的生物学过程和下游hub基因。WB验证在Necrostatin-1,z VAD-FMK干预下Bak1参与调控的下游蛋白THBS1表达水平。并检测Bak1-KO+THBS1-KD细胞株CCK-8,ATP及炎症因子(IL-6,IL-1β,TNFα)改变情况。3.结果:WB结果提示Bak1,P-MLKL蛋白表达在Oxy-Hb刺激后升高(P0.05)。碘化吡啶(propidium iodide,PI)染色明确在氧合血红蛋白刺激下小胶质细胞发生坏死。DCFH-DA探针及CCK-8及ATP测定提示小胶质细胞在Oxy-Hb刺激下活性氧升高,线粒体损伤,细胞活性下降(P0.05)。RT-q PCR检测促炎因子(IL-6,IL-1β,TNFα)在Oxy-Hb刺激下随时间点12h,24h升高(P0.05)。促炎表型基因(Irg-1,Gpr84)升高,抗炎表型基因(Arg-1,Mrc-1)下调(P0.05)。相关趋化因子(Ccl2,Ccl5,Cxcl2),趋化因子受体(Ccr5),一氧化氮合酶(Nos2)表达增加(P0.05),Oxy-Hb+z VAD-FMK组促炎因子(IL-6,IL-1β,TNFα)较DMSO组表达升高。RIPK3免疫共沉淀发现Oxy-Hb刺激24h后RIPK3与RIPK1和Bak1互作。WB发现z VAD-FMK诱导后Bak1表达升高,且Bak1-KO下调了P-MLKL的表达(P0.05)。CCK-8,ATP,DCFH-DA探针提示Bak1-KO改善了Oxy-Hb刺激下BV2细胞的细胞活力及受损的线粒体功能,降低氧化应激和细胞坏死(P0.05)。促炎表型基因(Gpr84,Irg-1)的表达(P0.05)和上清促炎因子(IL-6,IL-1β,TNFα)含量(P0.05),相关趋化因子(Ccl2,Ccl5,Cxcl2),趋化因子受体(Ccr5),一氧化氮合酶(Nos2)下调。敲除Bak1抑制IL-1β、TNFα在z VAD-FMK诱导的继续升高,但IL-6的表达没有改变。基因集富集分析(GSEA)发现Bak1-KD后与氧化应激,炎症反应相关生物学过程下调,抑炎相关生物学过程,线粒体膜电位调控及负调控内源性凋亡信号通路上调。GSEA多个通路提示THBS1可能为下游关键hub基因,蛋白质免疫印迹法(Westen blot,WB)表明Bak1-KO细胞株THBS1表达升高。同时THBS1在WT BV2 Nec-1组升高,z VAD-FMK组下调。通过检测NC,Bak1-KO NC,Bak1-KO+THBS1-KD细胞株在Oxy-Hb刺激下12h,24h时间点CCK8,ATP,发现敲低THBS1降低了Bak1-KO对小胶细胞的保护作用(P0.05)并使炎症因子IL-6,IL-1β,TNFα升高。结论:氧合血红蛋白刺激可诱导小胶质细胞诱导坏死性凋亡。同时小胶质细胞坏死性凋亡抑制小胶质细胞抗炎表型,诱导小胶质细胞向促炎表型转化,加重小胶质细胞介导的神经炎症。敲除Bak1蛋白能下调PMLKL的含量,减轻小胶质细胞的氧化应激,改善线粒体损伤并降低坏死性凋亡诱导的小胶质细胞促炎表型转化。免疫共沉淀提示RIPK3与Bak1存在蛋白质与蛋白质互作关系,提示Bak1可能在RIPK1/RIPK3复合体中发挥调控作用。通过RNA-Seq及生物信息学分析(GSEA)揭示干扰Bak1蛋白可以抑制多个炎症通路,氧化应激通路,稳定线粒体膜电位,并通过减轻内源性凋亡信号通路等机制减少小胶质细胞的坏死性凋亡及伴随的神经炎症,并部分机制是通过调控THBS1的表达来介导。3.敲减小胶质细胞Bak1减轻实验性蛛网膜下腔出血小胶质细胞坏死和神经炎症,改善神经功能评分。1.目的:为进一步探究敲减小胶质细胞Bak1蛋白能否减轻SAH后坏死性凋亡和神经炎症,同时改善神经功能评分而设计本次实验。2.方法:应用p AAV-CD68p-EGFP-Bak1-KD腺相关病毒对小胶质细胞Bak1蛋白进行敲减,在病毒感染3周后建立小鼠SAH模型。WB验证Bak1蛋白敲减效果,同时检测坏死性凋亡marker蛋白RIPK1/RIPK3变化情况。酶联免疫吸附(ELISA)检测脑组织中促炎因子(IL-6,IL-1β,TNFα)的含量。PI染色检测小胶质细胞坏死细胞数目的变化。改良加西亚(Garcia)评分及平衡木(Beam balance)评分,评估敲减小胶质细胞Bak1蛋白后小鼠发生蛛网膜下腔出血后神经功能评分改变情况。3.结果:蛋白质免疫印迹实验(Westen blot,WB)发现在WT小鼠早期脑损伤中Bak1蛋白较Sham升高(P0.05)。敲减小胶质细胞Bak1蛋白后,发现RIPK1在SAH24h模型脑组织中下调(P0.05)。ELISA提示,造模后Bak1敲减小鼠脑组织促炎因子(IL-6,IL-1β,TNFα)较NC对照组下调(P0.05),并PI阳性的小胶质细胞也同样减少。改良加西亚(Garcia)评分及平衡木(Beam balance)评分在Bak1敲减小鼠中得到改善。4.结论:特异性敲减小胶质细胞Bak1蛋白能减轻实验性蛛网膜下腔出血后坏死性凋亡marker蛋白RIPK1的表达,减少小胶质细胞的坏死,改善神经炎症和神经功能评分。降低小胶质细胞促炎因子分泌和下调损伤相关分子模式(DAMP)的释放可能是干扰Bak1蛋白改善神经功能的潜在机制。最后以减轻小胶质细胞的坏死性凋亡及其诱发的神经炎症为治疗靶点可能为SAH后早期脑损伤治疗提供新思路。