MST1对肝脏脂代谢的调控作用及其机制研究
作者单位：重庆医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：杨刚毅
授予年度：2022年
主 题：MST1 FFA 脂代谢 MAFLD 高脂饮食 MPHs 脂质沉积 腺病毒 慢病毒 脂滴 机制研究 铁死亡 XCT
摘 要：第一部分肝脏MST1的表达与MAFLD的关系目的:检测MST1在MAFLD患者、不同营养状态、胰岛素抵抗、肥胖模型中的表达,了解MST1与MAFLD的关系。方法:利用RT-PCR、WB、IHC、IF检测MST1的蛋白表达情况。从以下几个层面分别检测:MAFLD患者肝脏与对照组;WT（C57BL/6J）雄性小鼠各个组织、WT雄性小鼠空腹及再喂养组、WT雄性小鼠普食及高脂组、WT与db/db、ob/ob小鼠;HepG2细胞经BSA与FFA干预组。结果:Mst1在WT雄性小鼠中脾脏、心脏、脑、肝表达较高,肺、小肠中等表达;与空腹基线水平相比,Mst1的m RNA和蛋白水平再喂养时表达增加（P0.05）;MAFLD患者肝脏MST1蛋白表达明显较高（P0.05）;同时与普食喂养的WT小鼠相比,高脂喂养的WT小鼠,db/db、ob/ob小鼠其Mst1在肝脏的蛋白表达水平明显较高（P0.05）;在细胞层面,FFA干预条件下MST1表达明显高于BSA组（P0.05）。结论:MST1的高表达水平与MAFLD、肥胖、胰岛素抵抗正相关。第二部分Mst1调控肝脏脂代谢的体内研究目的:建立肝脏特异性过表达Mst1模型,运用高脂喂养条件诱导MAFLD,研究Mst1在肝脏脂代谢的调控作用。方法:8w的WT小鼠利用尾静脉病毒注射技术建立肝脏特异性过表达Mst1模型,分别予以普食及高脂饮食喂养。具体分组:NCD+AAV-TBG-m Cherry、NCD+AAV-TBG-Mst1、HFD+AAV-TBG-m Cherry、HFD+AAV-TBG-Mst1。连续喂养16w,每周检测体重、摄食。实验结束,测定肝重、组织染色、血脂、脂代谢重要基因以探索Mst1对于MAFLD的影响。结果:在普食喂养条件下,肝脏特异性过表达Mst1后,其体重、肝重、肝重/体重、摄食、血脂等未见明显差异（P0.05）。在高脂喂养条件下,肝脏特异性过表达Mst1后,其体重、肝重、肝重/体重、摄食、血脂明显增加（P0.05）;同时,过表达Mst1小鼠的体型较大,肝脏外观呈现更为严重的脂肪肝形态,HE染色显示肝炎症浸润及气球样变明显加重,油红O染色提示脂滴增加,天狼星红染色证实肝脏纤维化明显加重。脂质代谢基因检测其合成途径上调,摄取、氧化、分解等途径未见明显变化。结论:肝脏特异性过表达Mst1会加重高脂饮食诱导的MAFLD。第三部分MST1调控肝脏脂代谢的体外研究第一节过表达MST1促进肝细胞脂质沉积目的:探讨MST1在FFA诱导的肝细胞脂肪变性中的调控作用。方法:以人肝癌细胞HepG2与小鼠原代肝细胞（MPHs）为研究对象,采用1mM FFA（PA:OA=1:2）干预24h建立肝细胞脂肪变模型。分别采用慢病毒和腺病毒转染进行MST1过表达,探讨MST1在FFA诱导的肝细胞脂肪变性中的调控作用。检测肝细胞中脂质沉积及脂代谢重要基因的表达情况。结果:HepG2与MPHs中均成功过表达MST1并诱导肝细胞脂肪变性细胞模型。在两种细胞中,BSA干预条件下,脂滴沉积、脂质代谢无差异;但FFA干预条件下,与对照组比较,LV-MST1与Ad-Mst1组脂滴沉积明显增加,脂代谢合成基因m RNA与蛋白表达明显上调（P0.05）。结论:MST1加重FFA诱导的肝细胞脂质沉积。第二节抑制MST1改善肝细胞脂质沉积目的:探讨MST1在FFA诱导的肝细胞脂肪变性中的调控作用。方法:以人肝癌细胞HepG2与小鼠原代肝细胞（MPHs）为研究对象,采用1mM FFA（PA:OA=1:2）干预24h建立肝细胞脂肪变模型。慢病毒和腺病毒分别转染HepG2及原代肝细胞进行敲低MST1,双向探讨MST1在FFA诱导的肝细胞脂肪变性中的调控作用。检测肝细胞中脂质沉积及脂代谢相关基因的表达情况。结果:HepG2与MPHs中均成功敲低MST1并诱导肝细胞脂肪变性细胞模型。在两种细胞中,BSA干预条件下,两组间脂滴沉积、脂质代谢无差异,与过表达细胞模型结果一致;但FFA干预条件下,与对照组比较,LV-sh MST1与Ad-sh Mst1组脂滴沉积明显减少,脂代谢合成基因m RNA与蛋白表达明显下调（P0.05）。结论:抑制MST1改善FFA诱导的肝细胞脂质沉积。第四部分MST1调控脂代谢的机制研究第一节过表达MST1增加铁死亡敏感性促进肝细胞脂质沉积目的:探索MST1调控脂代谢的机制。方法:以HepG2细胞为研究对象,探索FFA干预后,过表达MST1细胞死亡相关表型的变化。结果:首先对MST1进行过表达,经BSA与FFA干预。检测细胞活性,过表达MST1降低细胞活性。细胞死亡抑制剂干预显示,铁死亡抑制剂能够逆转MST1及高脂诱导的细胞活性降低。同时FFA干预后脂质过氧化产物堆积,GSH降低,胞内Fe2+堆积,铁死亡关键蛋白（XCT/GPX4下调、FTH下降、TFR增加）,但ACSL4无明显差异。由此可见,在FFA干预脂代谢紊乱条件下,MST1过表达促进了铁死亡的发生。为了证明在脂代谢紊乱条件下MST1与铁死亡的关系,我们在诱导脂肪变性后分别在MST1干扰组和对照组使用铁死亡抑制剂观察脂质沉积表型。结果证实,在FFA干预条件下,抑制铁死亡改善脂质沉积,降低脂质合成基因表达。结论:MST1通过增加铁死亡敏感性促进脂质沉积。第二节抑制MST1降低铁死亡敏感性改善肝细胞脂质沉积目的:探索MST1调控肝脏脂代谢的机制。方法:以HepG2细胞为研究对象,探索FFA干预后,抑制MST1细胞死亡相关表型的变化。结果:抑制MST1,经BSA与FFA干预。检测细胞活性,抑制MST1逆转FFA降低的细胞活性。细胞死亡抑制剂干预显示,铁死亡抑制剂能够逆转MST1及高脂诱导的细胞活性降低。抑制MST1的表达,FFA干预后脂质过氧化产物减少,GSH增加,胞内Fe2+堆积减少,铁死亡关键蛋白（XCT/GPX4上调、FTH增加、TFR下降）,但ACSL4无明显差异。由此可见,在FFA干预脂代谢紊乱条件下,抑制MST1降低了铁死亡敏感性。为了证明在脂代谢紊乱条件下MST1与铁死亡的关系,我们在诱导脂肪变性后分别在MST1干扰组和对照组使用铁死亡诱导剂观察脂质沉积表型。结果证实,在FFA干预条件下,诱导铁死亡逆转抑制MST1降低的脂质沉积与脂质合成基因表达。结论:MST1降低,铁死亡敏感性下降,脂质沉积减少。
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