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BIOCELL 2022年第2期46卷 471-478页

作者： XINWEI WU GUOYONG JIA HONGNA YANG CONGCONG SUN YING LIU ZENGYAN DIAO Department of Geriatrics Qilu HospitalCheeloo College of MedicineShandong UniversityJinanChina Department of Neurology Qilu HospitalCheeloo College of MedicineShandong UniversityJinanChina Department of Critical-Care Medicine Qilu HospitalCheeloo College of MedicineShandong UniversityJinanChina

A progressive neurodegenerative disease,Alzheimer’s disease(AD).Studies suggest that highly expressed protein isoaspartate methyltransferase 1(PCMT1)in brain tissue.In the current study,we explored the effects of neural stem cell-conditioned medium(NSC-CDM)on the PCMT1/MST1 pathway to alleviate Aβ_(25-35)-induced damage in SH-SY5Y cells.Our data suggested that Aβ_(25-35) markedly inhibited cell viability.NSC-CDM or Neural stem cell-complete medium(NSC-CPM)had a suppression effect on toxicity when treatment with Aβ_(25-35),with a greater effect observed with NSC-CDM.Aβ_(25-35)+NSC-CDM group exhibited an increase in PCMT1 expression.sh-PCMT1 markedly decreased cell proliferation and suppressed the protective role of NSC-CDM through the induction of apoptosis and improved p-MST1 expression.Overexpression of PCMT1 reversed the Aβ_(25-35)-induced decrease in cell proliferation and apoptosis.In summary,our findings suggest that NSC-CDM corrects the Aβ_(25-35)-induced damage to cells by improving PCMT1 expressions,which in turn reduces phosphorylation of MST1.

关键词： Neural stem cell conditioned medium Protein isoaspartate methyltransferase 1 MST1 Amyloidβ_(25-35) Apoptosis

Hippo信号通路及其相关miRNA在AD与PD中潜在作用机制研究

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生物化学与生物物理进展 2024年

作者：刘醒然张蒙寇现娟广西医科大学体育与健康学院运动训练监控湖北省重点实验室武汉体育学院运动医学院

以阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）和帕金森病（Parkinson’s diseases，PD）为代表的神经退行性疾病主要特征是神经元进行性的不可逆丢失，导致不同程度的病理变化和认知功能的丧失，目前仍无有效的治疗方法。随着全球老龄... 详细信息

以阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）和帕金森病（Parkinson’s diseases，PD）为代表的神经退行性疾病主要特征是神经元进行性的不可逆丢失，导致不同程度的病理变化和认知功能的丧失，目前仍无有效的治疗方法。随着全球老龄化问题的加重，神经退行性疾病的患病人数正在快速上升，已发展成为严重的全球公共卫生事件，迫切需要开发有效的治疗手段。Hippo信号通路是一种高度进化保守的途径，在细胞增殖、分化、发育以及凋亡等生物过程中发挥重要作用，并与miRNA互相作用产生广泛的生物效应，在多种疾病的发生中互相串扰。但在神经退行性疾病中对Hippo信号通路与miRNA的探讨相对缺乏。本文通过梳理Hippo信号通路以及相关miRNA在AD与PD中的作用机制，探讨其内在联系，以期拓展神经退行性疾病的治疗视野，为神经退行性疾病的防治提供新的思路和视角。

关键词：衰老神经退行性疾病 Hippo信号通路 MST1 YAP

壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠MST1、YAP、LATS1表达的影响

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壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠MST1、YAP、LATS1表达的影响

作者：张晓梅广西中医药大学

学位级别：硕士

目的:本课题以肝纤维化大鼠模型为研究对象,探究壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠中MST1、YAP、LATS1表达的影响,进而探究壮肝逐瘀煎抗肝纤维化的作用机制,为壮肝逐瘀煎防治肝纤维化提供客观依据。方法:60只SD大鼠适应性喂养一周,随机选取50只... 详细信息

目的:本课题以肝纤维化大鼠模型为研究对象,探究壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠中MST1、YAP、LATS1表达的影响,进而探究壮肝逐瘀煎抗肝纤维化的作用机制,为壮肝逐瘀煎防治肝纤维化提供客观依据。方法:60只SD大鼠适应性喂养一周,随机选取50只构建肝纤维化模型,余下10只为空白组。皮下注射40%的CCL4花生油溶液,首次注射的量为0.5 ml/100g,后面每次注射的量为0.3 ml/100g,一周3次,于第6周、第8周分别取5只造模大鼠进行HE、Masson染色,观察造模是否成功。模型成功后,将造模大鼠随机分为模型组、秋水仙碱组、壮肝逐瘀煎高、中、低剂量组（ZGZYJ高、中、低剂量组）。ZGZYJ高、中、低剂量组的灌胃剂量分别是:26.46 g/kg、13.23 g/kg、6.615 g/kg,秋水仙碱组的灌胃剂量是:0.126 mg/kg,空白组与模型组则给予等量的生理盐水,一天1次,持续药物干预6周。各组最后一次给药后,禁食不禁水12 h,大鼠称重并记录体重。麻醉后进行腹腔主动脉取血,室温下静置2 h,离心取上层血清用全自动生化仪检测ALT、AST、ALB、ALP等肝功能指标。取大鼠肝脏,观察肝脏组织形态,并取肝右组织2份,1份置于10%甲醛固定,1份于-80℃冰箱冷冻备用。固定的肝脏组织作病理切片,进行HE、Masson染色,于显微镜下观察肝脏组织的病理形态。取-80℃冰箱冷冻的肝脏组织进行WB、RT-PCR等检测,分别观察肝脏组织中MST1、YAP、LATS1的蛋白、m RNA表达水平。结果:1.大鼠的一般情况给药各组大鼠毛发颜色、光泽度较好,精神、活动能力、大便形状以及颜色等均较前明显改善。给药各组大鼠体重的增长趋势高于模型组,但较空白组缓慢,无统计学意义。壮肝逐瘀煎治疗组大鼠肝脏边缘变锐利、肝体肿胀减轻,无明显颗粒状,表面光泽度尚可,质地柔软,外表颜色相似接近红褐色。秋水仙碱组大鼠肝脏颗粒减少,边缘较钝,颜色偏黄白色。2.壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠血清中ALT、AST、ALB、ALP水平的影响与模型组相比,壮肝逐瘀煎高剂量组大鼠血清中ALT、AST水平下降,ALB水平升高（P＜0.01）,壮肝逐瘀煎中、低剂量组大鼠血清中ALT、ALP水平下降（P＜0.01,P＜0.05）,ALB水平升高（P＜0.01）,秋水仙碱组大鼠血清中ALT水平下降（P＜0.05）。3.壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠组织形态变化的影响HE与Masson的结果表明,与模型组相比,壮肝逐瘀煎治疗组肝细胞坏死、变形的数量减少,纤维组织增生、纤维间隔区域面积减少,炎症细胞浸润程度减轻,未见假小叶形成。秋水仙碱组纤维间隔区域面积有一定程度的改善。4.壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠中MST1、YAP、LATS1表达的影响（1）WB结果:与空白组相比,模型组肝脏组织中YAP蛋白的表达上升（P＜0.05）,LATS1蛋白的表达降低（P＜0.01）,MST1蛋白的表达降低,差异无统计学意义。与模型组相比,壮肝逐瘀煎高剂量组肝脏组织中LATS1蛋白的表达明显升高（P＜0.01）,壮肝逐瘀煎中剂量组肝脏组织中YAP蛋白的表达降低、LATS1蛋白的表达升高（P＜0.01,P＜0.05）,壮肝逐瘀煎低剂量组肝脏组织中MST1蛋白的表达升高（P＜0.01）,秋水仙碱组肝脏组织中MST1蛋白的表达升高（P＜0.05）,YAP蛋白的表达降低（P＜0.01）。（2）PCR结果:与空白组相比,模型组肝脏组织中MST1 m RNA的表达下降,但无统计学意义,LATS1 m RNA的表达下降,YAP m RNA的表达上升（P＜0.01）。与模型组相比,壮肝逐瘀煎高、中、低剂量组、秋水仙碱组肝脏组织中MST1、LATS1 m RNA的表达升高,YAP m RNA的表达下降（P＜0.01）。结论:1.壮肝逐瘀煎可以明显改善肝纤维化大鼠肝功能、减轻肝脏组织肝纤维化程度,有很好的护肝作用。2.壮肝逐瘀煎抗肝纤维化的作用机制可能是通过上调MST1、LAST1的表达,下调YAP的表达。

关键词：壮肝逐瘀煎肝纤维化 MST1 YAP LATS1

MST1介导的自噬在高血压小鼠心肌细胞损伤中的作用

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Mst1介导的自噬在高血压小鼠心肌细胞损伤中的作用

作者：邓云辉新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨MST1（Mammalian Sterile20-like Kinase1）过表达介导的自噬在高血压小鼠心肌微血管内皮细胞损伤中的作用。方法:通过CCK-8、MDA、SOD检测细胞活力确定血管紧张素II浓度（Ang II）及干预时间。然后用浓度为100umol/L的Ang II... 详细信息

目的:探讨MST1（Mammalian Sterile20-like Kinase1）过表达介导的自噬在高血压小鼠心肌微血管内皮细胞损伤中的作用。方法:通过CCK-8、MDA、SOD检测细胞活力确定血管紧张素II浓度（Ang II）及干预时间。然后用浓度为100umol/L的Ang II干涉小鼠心肌细胞24小时,从而来建立高血压细胞模型。实验分组:对照组:心肌细胞常规培养48h,Ang II组:心肌细胞常规培养24h后,Ang II浓度100umol/L再干预24h,Ang II+Ad-NC组:用携带感染CON267的腺病毒转染心肌细胞后在Ang II浓度（100umol/L）下干预24h建立高血压细胞模型,Ang II+Ad-MST1组:用携带感染AD-Stk4的腺病毒转染心肌细胞后在Ang II浓度（100umol/L）下干预24h建立高血压细胞模型;观察自噬量及形状、线粒体膜电位水平、细胞凋亡水平以及检测MDA、SOD、GSH-Px的含量。结果:透射电镜观察自噬小体结果提示:与对照组相比,Ang II组、Ang II+Ad-MST1显著减少,与Ang II组相比,Ang II+Ad-MST1显著减少（P均＜0.05）;JC-1法检测线粒体膜电位结果发现:与对照组相比,Ang II组、Ang II+Ad-MST1是降低的,与Ang II组相比,Ang II+Ad-MST1组也是降低的（P均＜0.05）;各组凋亡率的结果提示:Ang II组、Ang II+Ad-MST1凋亡率较对照组是升高的,与Ang II组相比,Ang II+Ad-MST1组也是升高的（P均＜0.05）;氧化应激水平结果提示:与对照组相比,Ang II组、Ang II+Ad-MST1组的MDA增加,SOD、GSH-PX减少（P均＜0.05）;与Ang II组相比,Ang II+Ad-MST1组的MDA增加的,SOD及GSH-PX是降低的（P均＜0.05）。结论:MST1过表达能够抑制高血压状态下心肌微血管内皮细胞自噬水平,促进凋亡和线粒体损伤;MST1介导的自噬在高血压心肌损伤中起着重要的作用。

关键词： MST1 高血压心肌微血管内皮细胞自噬凋亡

Hippo/MST1在围术期神经认知障碍中的作用及机制研究

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Hippo/MST1在围术期神经认知障碍中的作用及机制研究

作者：展巧稚宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的通过建立围术期神经认知障碍(PND)模型,检测老年小鼠海马组织中MST1、P-mst、TNF-a、IL-1Β蛋白的表达水平。探讨Hippo通路磷酸化激活是否参与围术期神经认知功能障碍的发病机制。通过腹腔注射XMU-MP-1阻断Hippo/MST1信号、水迷宫... 详细信息

目的通过建立围术期神经认知障碍(PND)模型,检测老年小鼠海马组织中MST1、P-mst、TNF-a、IL-1Β蛋白的表达水平。探讨Hippo通路磷酸化激活是否参与围术期神经认知功能障碍的发病机制。通过腹腔注射XMU-MP-1阻断Hippo/MST1信号、水迷宫行为测试及老年小鼠海马炎症因子检测,初步探讨Hippo/MST1信号在围术期神经认知障碍中的作用及可能机制。方法第一部分:本部分实验主要检测PND小鼠术后P-MST1、MST1表达变化。健康雄性14月龄SPF级C57BL/6J小鼠(体重35-45g),随机分为Sham组和PND组,每组24只,每个时间点各6只。小鼠在动物房适应一周后开始进行实验,术前连续6天对老年小鼠进行定位航行训练以检测老年小鼠学习能力,采用老年小鼠胫骨骨折髓内固定术建立围术期神经认知障碍动物模型,术后进行空间探索实验评价老年小鼠术后1、5、7、14天的记忆能力,用Western blot方法检测老年小鼠海马区术后1、5、7、14天MST1、P-MST1的表达。第二部分:本部分实验主要通过腹腔注射抑制剂XMU-MP-1检测对PND小鼠的改善作用。选取健康雄性14月龄SPF级C57BL/6J小鼠40只(体重35-45g),随机分为Sham组、PND组、PND+Vehicle组、PND+XMU-MP-1组,每组10只。Sham组仅切开皮肤进行缝合,不行胫骨骨折骨折髓内固定手术,其余组行胫骨骨折髓内钉固定术处理,PND+XMU-MP-1组小鼠使用XMU-MP-1干预,在麻醉前半小时和术后每天于相同时间点腹腔注射XMU-MP-1 2mg/kg,连续7d,Vehicle组腹腔注射等量溶剂。术后第7天行水迷宫空间探索实验后立即处死取材,一半小鼠(n=5)用于Western blot实验检测MST1、P-MST1分子的表达情况,一半小鼠(n=5)用于ELISA实验检测炎性因子TNF-a、IL-1β的表达情况。空间探索实验选取逃避潜伏期、目标象限停留时间百分比、逃逸平台进入次数作为检测指标评估小鼠记忆功能。结果第一部分:水迷宫定位航行训练结果显示,每天对小鼠进行水迷宫训练使得老年小鼠更容易找到隐藏在水下的平台,小鼠找到隐藏在水下平台所需要的时间缩短(P﹤0.01),小鼠找到平台的游泳距离也是缩短的。水迷宫空间探索实验结果显示,与Sham组相比,行胫骨骨折髓内固定术后发生PND的老年小鼠在术后1、5、7天各个时间点找到隐藏在水下平台所用的时间明显延长(P﹤0.01),在平台所在的目标象限花费的时间百分比明显降低(P﹤0.01),逃逸平台进入次数也显著减少(P﹤0.01)。与Sham组相比,术后第14天老年PND小鼠的逃避潜伏期、目标象限停留时间百分比,逃逸平台进入次数无明显差异(P>0.05)。实验过程中,小鼠的游泳速度无明显差异。Western blot实验检测PND小鼠海马组织中的MST1、P-MST1蛋白表达。结果显示,与Sham组相比,老年PND模型小鼠海马区MST1异常磷酸化,术后1、5、7天P-MST1水平升高(PMST1水平增加更为明显,术后14天P-MST1表达水平出现下降趋势,但MST1总蛋白的表达水平不发生变化。第二部分:术后第7天使用XMU-MP-1抑制剂抑制MST1磷酸化后,水迷宫定位航行训练结果显示,与Sham组相比,PND组小鼠术后到达隐藏在水下平台所需时间(潜伏期)增加(P﹤0.01)、目标象限滞留时间百分比降低(P﹤0.01)、逃逸平台进入次数减少(P﹤0.01),游泳速度无变化(P>0.05)。与PND组相比,PND+XMU-MP组潜伏期缩短(P﹤0.05)、目标象限滞留时间百分比增加(P﹤0.05)、逃逸平台进入次数增加(P﹤0.05)、各组小鼠的游泳速度无明显差异(P>0.05)。Westernblot结果显示,与Sham组相比,PND组P-MST1的表达水平明显增高(P﹤0.01),与PND组相比,PND+XMU-MP-1组P-MST1水平显著降低(P﹤0.01)。PND组与PND+Vehicle组实验结果差异无统计学意义(P>0.05)。表明腹腔注射XMU-MP-1成功抑制了Hippo信号通路MST1的激活。ELISA检测海马组织炎性因子表达,实验结果显示,与Sham组相比,PND组、PND+Vehicle组、PND+XMU-MP-1组TNF-a、IL-1β表达明显升高(P﹤0.01)。与PND组相比,PND+XMU-MP-1组TNF-a、IL-1β的表达水平显著降低(P﹤0.05)。PND组与PND+Vehicle组实验结果差异无统计学以意义。结论:Hippo/MST1在老年小鼠PND模型中异常激活,P-MST1表达水平增高,抑制P-MST1表达可能通过下调海马区炎症因子使PND老年小鼠认知障碍进一步改善,提示Hippo/MST1激活在

关键词：围术期神经认知障碍神经炎症 Hippo通路 MST1

褪黑素调控MST1在高血压小鼠心肌微血管内皮细胞损伤中的作用及机制研究

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褪黑素调控Mst1在高血压小鼠心肌微血管内皮细胞损伤中的作用及机...

作者：王薇新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨褪黑素(Melatonin,MT)对于高血压状态下的小鼠心肌微血管内皮细胞(Cardiac microvascular endothelial cells,CMEC)损伤是否可以通过调控MST1(Mammalian Sterile20-like Kinase1)来起到保护作用。方法:采用细胞复苏、细胞传代、细胞冻存方法培养小鼠心肌微血管内皮细胞,利用浓度为100umol/L的血管紧张素II(Ang II)干预24h建立高血压细胞模型,使用浓度为1mmol/L的褪黑素再次进行干预。实验分为7组:对照组:心肌细胞在常规条件下培养48h,高血压组(HP组):心肌细胞在常规条件下培养24h后,Ang II浓度100umol/L干预24h,高血压+阴性对照组(HP+Ad-NC组):Ang II浓度100umol/L干预24h,同时感染阴性对照CON267腺病毒48h,高血压+MST1过表达组(HP+Ad-MST1组):浓度为100umol/L的Ang II干预24h,同时感染AD-Stk4腺病毒48h,高血压+褪黑素组(HP+MT组):心肌细胞常规培养24h后,褪黑素MT(1mmol/L)于Ang II干预前1h进行干预24h,Ang II浓度100umol/L干预24h,高血压+阴性对照组+褪黑素(HP+Ad-NC+MT组):褪黑素MT(1mmol/L)于Ang II干预前1h进行干预24h,Ang II浓度100umol/L干预24h,同时感染阴性对照CON267腺病毒48h,高血压+MST1过表达组+褪黑素(HP+Ad-MST1+MT组):褪黑素MT(1mmol/L)于Ang II干预前1h进行干预24h,浓度为100umol/L的Ang II干预24h,同时感染AD-Stk4腺病毒48h。通过透视电镜观察自噬小体数量,流式细胞仪检测细胞凋亡程度以及使用JC-1方法检测线粒体膜的电位水平,酶标仪比色法测定MDA、SOD、GSH-Px的含量。结果:在MT干预后,自噬小体数量增多,自噬增强。以细胞凋亡结果及细胞线粒体的膜电位结果可以看出,HP+MT组细胞凋亡、JC-1单体比例显著低于HP组(PMST1组相比,HP+Ad-MST1+MT组细胞凋亡降低、JC-1单体比例显著减少(PMST1组相比,HP+Ad-MST1+MT组MDA含量显著降低(PMST1过表达产生的细胞凋亡,使线粒体膜电位提高,抑制MST1过表达,以上说明褪黑素可能可以通过调控MST1来保护心肌。

关键词：褪黑素 MST1 高血压心肌损伤心肌微血管内皮细胞凋亡

MST1对肝脏脂代谢的调控作用及其机制研究

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MST1对肝脏脂代谢的调控作用及其机制研究

作者：向婷重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分肝脏MST1的表达与MAFLD的关系目的:检测MST1在MAFLD患者、不同营养状态、胰岛素抵抗、肥胖模型中的表达,了解MST1与MAFLD的关系。方法:利用RT-PCR、WB、IHC、IF检测MST1的蛋白表达情况。从以下几个层面分别检测:MAFLD患者肝脏... 详细信息

第一部分肝脏MST1的表达与MAFLD的关系目的:检测MST1在MAFLD患者、不同营养状态、胰岛素抵抗、肥胖模型中的表达,了解MST1与MAFLD的关系。方法:利用RT-PCR、WB、IHC、IF检测MST1的蛋白表达情况。从以下几个层面分别检测:MAFLD患者肝脏与对照组;WT（C57BL/6J）雄性小鼠各个组织、WT雄性小鼠空腹及再喂养组、WT雄性小鼠普食及高脂组、WT与db/db、ob/ob小鼠;HepG2细胞经BSA与FFA干预组。结果:MST1在WT雄性小鼠中脾脏、心脏、脑、肝表达较高,肺、小肠中等表达;与空腹基线水平相比,MST1的m RNA和蛋白水平再喂养时表达增加（P＜0.05）;MAFLD患者肝脏MST1蛋白表达明显较高（P＜0.05）;同时与普食喂养的WT小鼠相比,高脂喂养的WT小鼠,db/db、ob/ob小鼠其MST1在肝脏的蛋白表达水平明显较高（P＜0.05）;在细胞层面,FFA干预条件下MST1表达明显高于BSA组（P＜0.05）。结论:MST1的高表达水平与MAFLD、肥胖、胰岛素抵抗正相关。第二部分MST1调控肝脏脂代谢的体内研究目的:建立肝脏特异性过表达MST1模型,运用高脂喂养条件诱导MAFLD,研究MST1在肝脏脂代谢的调控作用。方法:8w的WT小鼠利用尾静脉病毒注射技术建立肝脏特异性过表达MST1模型,分别予以普食及高脂饮食喂养。具体分组:NCD+AAV-TBG-m Cherry、NCD+AAV-TBG-MST1、HFD+AAV-TBG-m Cherry、HFD+AAV-TBG-MST1。连续喂养16w,每周检测体重、摄食。实验结束,测定肝重、组织染色、血脂、脂代谢重要基因以探索MST1对于MAFLD的影响。结果:在普食喂养条件下,肝脏特异性过表达MST1后,其体重、肝重、肝重/体重、摄食、血脂等未见明显差异（P＞0.05）。在高脂喂养条件下,肝脏特异性过表达MST1后,其体重、肝重、肝重/体重、摄食、血脂明显增加（P＜0.05）;同时,过表达MST1小鼠的体型较大,肝脏外观呈现更为严重的脂肪肝形态,HE染色显示肝炎症浸润及气球样变明显加重,油红O染色提示脂滴增加,天狼星红染色证实肝脏纤维化明显加重。脂质代谢基因检测其合成途径上调,摄取、氧化、分解等途径未见明显变化。结论:肝脏特异性过表达MST1会加重高脂饮食诱导的MAFLD。第三部分MST1调控肝脏脂代谢的体外研究第一节过表达MST1促进肝细胞脂质沉积目的:探讨MST1在FFA诱导的肝细胞脂肪变性中的调控作用。方法:以人肝癌细胞HepG2与小鼠原代肝细胞（MPHs）为研究对象,采用1mM FFA（PA:OA=1:2）干预24h建立肝细胞脂肪变模型。分别采用慢病毒和腺病毒转染进行MST1过表达,探讨MST1在FFA诱导的肝细胞脂肪变性中的调控作用。检测肝细胞中脂质沉积及脂代谢重要基因的表达情况。结果:HepG2与MPHs中均成功过表达MST1并诱导肝细胞脂肪变性细胞模型。在两种细胞中,BSA干预条件下,脂滴沉积、脂质代谢无差异;但FFA干预条件下,与对照组比较,LV-MST1与Ad-MST1组脂滴沉积明显增加,脂代谢合成基因m RNA与蛋白表达明显上调（P＜0.05）。结论:MST1加重FFA诱导的肝细胞脂质沉积。第二节抑制MST1改善肝细胞脂质沉积目的:探讨MST1在FFA诱导的肝细胞脂肪变性中的调控作用。方法:以人肝癌细胞HepG2与小鼠原代肝细胞（MPHs）为研究对象,采用1mM FFA（PA:OA=1:2）干预24h建立肝细胞脂肪变模型。慢病毒和腺病毒分别转染HepG2及原代肝细胞进行敲低MST1,双向探讨MST1在FFA诱导的肝细胞脂肪变性中的调控作用。检测肝细胞中脂质沉积及脂代谢相关基因的表达情况。结果:HepG2与MPHs中均成功敲低MST1并诱导肝细胞脂肪变性细胞模型。在两种细胞中,BSA干预条件下,两组间脂滴沉积、脂质代谢无差异,与过表达细胞模型结果一致;但FFA干预条件下,与对照组比较,LV-sh MST1与Ad-sh MST1组脂滴沉积明显减少,脂代谢合成基因m RNA与蛋白表达明显下调（P＜0.05）。结论:抑制MST1改善FFA诱导的肝细胞脂质沉积。第四部分MST1调控脂代谢的机制研究第一节过表达MST1增加铁死亡敏感性促进肝细胞脂质沉积目的:探索MST1调控脂代谢的机制。方法:以HepG2细胞为研究对象,探索FFA干预后,过表达MST1细胞死亡相关表型的变化。结果:首先对MST1进行过表达,经BSA与FFA干预。检测细胞活性,过表达MST1降低细胞活性。细胞死亡抑制剂干预显示,铁死亡抑制剂能够逆转MST1及高脂诱导的细胞活性降低。同时FFA干预后脂质过氧化产物堆积,GSH降低,胞内Fe2+堆积,铁死亡关键蛋白（XCT/GPX4下调、FTH下降、TFR增加）,但ACSL4无明显差异。由此可见,在FFA干预

关键词： MST1 FFA 脂代谢 MAFLD 高脂饮食 MPHs 脂质沉积腺病毒慢病毒脂滴机制研究铁死亡 XCT

远隔预处理诱导缺血脑保护中差异基因表达的研究

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远隔预处理诱导缺血脑保护中差异基因表达的研究

作者：赵钰萤锦州医科大学

学位级别：硕士

目的脑卒中(stroke)是全球第二大致死病因,而缺血性脑卒(Ischemic stroke,IS)中约占全部脑卒中的85%,成为防治脑卒中的关键。远隔预处理(Remote ischemic preconditioning,RIPC)是一种通过对远端器官实施缺血预处理后,能增强心、脑和肾... 详细信息

目的脑卒中(stroke)是全球第二大致死病因,而缺血性脑卒(Ischemic stroke,IS)中约占全部脑卒中的85%,成为防治脑卒中的关键。远隔预处理(Remote ischemic preconditioning,RIPC)是一种通过对远端器官实施缺血预处理后,能增强心、脑和肾等生命重要器官缺血耐受的方法。RIPC能多靶点和多途径拮抗脑缺血的病理生理过程而发挥脑保护作用,是近年来神经科学研究领域的热点。课题组前期研究发现RIPC能够降低脑损伤的梗死面积、减轻脑组织水肿、改善血脑屏障的通透性及促进神经功能的恢复,相关实验也证实了RIPC具有改善脑缺血后脑血流量、能量代谢及抗兴奋性毒害的作用。然而,有关RIPC缺血脑保护分子机制的研究整体上仍处于初始阶段,尚未揭示参与调控RIPC诱导缺血脑保护作用的关键分子机制。因此,本研究旨在通过微阵列基因芯片对RIPC早期和延迟保护阶段变化的差异基因进行生物信息学方法分析,进而探讨RIPC中可能发挥作用的关键基因,为RIPC脑保护作用的深入研究提供一定的理论参考。方法健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(11-12周龄,体重270-320g)27只,随机分为假手术组(shame,n=3),脑缺血组(IS,n=12)和远隔缺血预处理组(RIPC,n=12)。脑缺血组和远隔缺血预处理组分别再设置1h、3h、6h和24h四个亚组。脑缺血组通过建立远端大脑中动脉阻塞(dMCAO,distal middle cerebral artery infarction occlusion)模型实现。远端大脑中动脉阻塞模型制作如下:永久阻断左侧大脑中动脉远端并夹闭双侧颈总动脉(CCAO,common carotid artery occlusion)30min即成功制作。远隔缺血预处理组对左侧股动脉行3个循环的15 min夹闭/15 min再灌注后,再进行远端大脑中动脉阻塞模型构建。假手术组不行双侧颈总动脉夹闭和大脑中动脉电凝,其他操作过程同脑缺血组。在此基础上,分别取各组大脑皮层缺血半暗带并提取总RNA,随后用微阵列基因芯片分析检测mRNA的表达,并通过GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、PPI(Protein-Protein Interaction Networks)、GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)和CIBERSORT多种生物学信息方法对RIPC早期阶段(1 h、3 h、6 h和24 h的差异基因数目分别为623、854、1019和2915个;而IS组1 h、3 h、6 h和24 h的差异基因数目分别为354、628、923和2268个。首先,我们开展了RIPC早期(1 h和3 h筛选出的差异基因和IS组筛选出的差异基因取交集,将其分为三部分:RIPC早期独有差异基因(RIPC＿DEGs)、IS早期独有差异基因(IS＿DEGs)和共表达差异基因(Co-expressed＿DEGs)。对这三部分差异基因分别进行GO和KEGG分析,发现RIPC显著富集G蛋白偶联信号通路和嗅觉转导通路。然而,IS早期独有差异基因和早期共表达差异基因均显著富集炎症反应。进一步对RIPC早期独有差异基因中表达最高的60位和早期共表达差异基因中RIPC发挥调控的部分差异基因进行分析。发现RIPC仍显著富集G蛋白偶联信号通路和嗅觉转导通路。筛选出的四个差异基因Rreb1、Cxcl11、Ptgs2和Olr1356均与神经心血管系统有关,可能为RIPC早期的关键基因。其次,我们对RIPC 24 h差异基因进行了分析,结果显示RIPC 24 h独有差异基因(RIPC24h＿DEGs)能显著富集神经活性受体配体通路。在此基础上,进一步对该部分基因开展了免疫相关分析,发现RIPC24h＿DEGs差异基因中共有28位免疫相关基因,其中免疫基因Bmp2、Ccn1、Inhba、Npy与RIPC调控的免疫细胞有相关行。最后,依据1 h、3 h、6 h和24 h时间点动态分析了RIPC的作用机制,发现信号通路(TNFa signaling via NFkB,Inflammtory response,Interferon gamma response,Allograft rejection,IL6 JAK STAT3 signaling)

关键词：脑卒中远隔缺血预处理富集分析糖氧剥夺 MST1 CXCL11 免疫浸润

FTY720通过miR-494/MST1抑制结肠癌细胞并增加吉西他滨敏感性的分子机制

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世界华人消化杂志 2020年第6期28卷 217-225页

作者：薛珊邢颖宋华伟陆军第七十二集团军医院消化内科浙江省湖州市313000 陆军第七十二集团军医院特诊科浙江省湖州市313000

背景结肠癌在我国恶性肿瘤中发病率和死亡率均居第5位,化疗是其主要治疗方式,有研究表明免疫抑制剂FT Y720对癌症细胞增殖起一定的抑制作用,抑制剂联合化疗药物可提高癌症治疗效果.本研究使用免疫抑制剂FTY720与吉西他滨联合处理结肠癌... 详细信息

背景结肠癌在我国恶性肿瘤中发病率和死亡率均居第5位,化疗是其主要治疗方式,有研究表明免疫抑制剂FT Y720对癌症细胞增殖起一定的抑制作用,抑制剂联合化疗药物可提高癌症治疗效果.本研究使用免疫抑制剂FTY720与吉西他滨联合处理结肠癌细胞,并探索miR-494/哺乳动物Ste20样激酶1 (mammalian Ste20-like kinase 1,MST1)对在此过程中对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响,以期为结肠癌的治疗提供新的思路.目的研究FT Y720和吉西他滨对结肠癌细胞存活率和凋亡的影响和潜在的分子机制.方法用0.0001μg/mL、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL的吉西他滨和2.5μmol/L、5μmol/L、7.5μmol/L、10μmol/L、12.5μmol/L的FTY720处理结肠癌SW1116细胞,CCK8法和流式细胞术检测SW1116细胞存活率和凋亡率,实时定量聚合酶链式反应检测miR-494和MST1 mRNA的含量,Western blot检测MST1、p21和Caspase-3蛋白表达水平,双荧光素酶报告系统验证miR-494与MST1的调控关系.结果吉西他滨(0.0001μg/mL、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL)和FTY720 (2.5μmol/L、5μmol/L、7.5μmol/L、10μmol/L、12.5μmol/L)均可降低结肠癌SW1116细胞的存活率,且具有浓度依赖性,根据结果选取抑制率约为50%的0.1μg/mL吉西他滨和10μmol/L的FTY720进行后续实验,吉西他滨和FT Y720均可抑制细胞存活并促进细胞凋亡,且联合使用比单独使用效果更好;过表达miR-494可逆转FTY720、吉西他滨对SW1116细胞存活率和凋亡的作用;miR-494靶向调控MST1;抑制MST1可逆转FTY720和吉西他滨对SW1116细胞存活率和凋亡的影响.结论FTY720和吉西他滨通过miR-494/MST1抑制SW1116细胞存活,促进细胞凋亡.FTY720和吉西他滨对结肠癌SW1116具有抑制作用,且联合使用效果更佳.

关键词：结肠癌 FTY720 吉西他滨 miR-494 MST1 存活率凋亡率

雄激素受体水平与主动脉夹层发生发展的相关性研究

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雄激素受体水平与主动脉夹层发生发展的相关性研究

作者：何雨祯中国医科大学

学位级别：硕士

目的:主动脉夹层（Aortic dissection,AD）是一种常见的血管外科急症,它是胸主动脉,主动脉弓及升主动脉的内膜破裂,血液涌入血管壁,中层平滑肌及外膜撕裂所形成血管真假腔为特点的血管节段性病变。疾病的发生伴随着血管壁的严重损伤与... 详细信息

目的:主动脉夹层（Aortic dissection,AD）是一种常见的血管外科急症,它是胸主动脉,主动脉弓及升主动脉的内膜破裂,血液涌入血管壁,中层平滑肌及外膜撕裂所形成血管真假腔为特点的血管节段性病变。疾病的发生伴随着血管壁的严重损伤与结构重整,具有潜在的死亡风险。性别与年龄是疾病发生发展的相关因素。我们的前期研究发现AD男性患者雄性激素水平往往更低,通过血清学分析得出雄性激素的降低会促进AD的发生发展。有研究发现雄激素受体（Androgen receptor,AR）调节HIPPO通路,AR可以结合YAP促使其核内转移从而促进相应蛋白的表达,维持细胞的增殖与代谢,减少其凋亡的发生。也有研究发现AR与MST1相互作用,雄激素通路与HIPPO信号通路存在调节关系。HIPPO通路在AD的发生过程中会被激活,间接导致血管壁细胞凋亡的增加。研究发现血管壁机械应力的增加会激活HIPPO信号通路,诱导YAP磷酸化。YAP在血管应力增加后明显降低表达,促使血管平滑肌细胞发生凋亡。鉴于此我们进一步探究阻断AR是否会通过调节HIPPO通路的异常激活加剧血管平滑肌细胞的凋亡及细胞外基质的重构进而导致夹层发生。研究方法:选取3周50g SD大鼠,随机进行分组HC,VEHICLE,Flutamide+BAPN,BAPN组,每组各20只大鼠。采用0.25%BAPN水溶液法进行AD模型建立。Flutamide腹腔注射进行AR阻断模型的建立,通过采用HE与EVG染色法进行夹层形态学与弹力纤维的评估,采用ELISA法检测血清脂代谢水平,蛋白印迹（Western-blot）与免疫组化（Immunohistochemical,IHC）及免疫荧光（Immunofluorescence,IF）法分别对AR阻断情况进行评估,检测MMP2与MMP9蛋白来评估细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）降解状况。同时对HIPPO信号通路关键蛋白MST1,YAP,p-YAP进行分析,在组织切片上染色定位。最后采用Tunel法检测凋亡的细胞以及Western-blot法检测Cleaved-caspase3凋亡蛋白表达情况。结果:雄激素受体阻断后动脉夹层的形成会加剧,表现为夹层破口增加及夹层发生率增加。结果显示Flutamide+BAPN组夹层形成率为75%,BAPN组夹层形成率为35%,其余组别未见夹层出现（p＜0.001）。WB检测发现Flutamide阻断后AR表达明显降低（p＜0.01）。HE与EVG染色形态学评估HC,VEHICLE,Flutamide+BAPN组和BAPN组血管形态及弹力蛋白断裂水平,Flutamide+BAPN组和BAPN组中出现AD且弹力纤维断裂降解,Flutamide+BAPN组AD破口加剧。MMP2与MMP9蛋白在Flutamide+BAPN组表达显著增加,BAPN组表达可见增加,其余组别表达水平低（P＜0.001,P＜0.01）。HIPPO信号通路相关蛋白表达量上升,MST1,p-YAP的表达含量在Flutamide+BAPN组大量表达,BAPN组部分表达,HC和VEHICLE未见明显表达（P＜0.01,P＜0.001）。YAP的表达水平与MST1在各组间表达趋势相反（P＜0.01）,YAP的磷酸化降解间接导致细胞凋亡发生。Tunel检测发现Flutamide+BAPN组平滑肌细胞大量凋亡,BAPN组的部分细胞发生凋亡,未在对照组发现细胞凋亡发生（P＜0.001）。结论:雄激素受体在动脉夹层形成中起保护作用。在动脉夹层的形成过程中,HIPPO通路会被异常激活且表达量与夹层撕裂破口程度呈正相关。AR与MST1结合会减弱HIPPO通路的异常激活,同时减弱下游凋亡信号的传递,阻止平滑肌细胞凋亡的发生,细胞外基质的重构,从而抑制夹层的发生。

关键词：主动脉夹层 HIPPO信号通路 MST1 YAP 凋亡