cGAS在调控肺腺癌细胞吉非替尼耐药中的作用

作     者：李久康 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈虹

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：非小细胞肺癌 吉非替尼耐药 cGAS PARP1 

摘      要：目的:吉非替尼是能够显著改善非小细胞肺癌（NSCLC）患者预后的分子靶向药,虽然对于治疗EGFR突变的非小细胞肺癌具有显著的疗效,但最终大多数患者会发生耐药,从而限制其临床应用,目前吉非替尼耐药机制尚未完全阐明。环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase,cGAS）是一种核酸转移酶,通过抑制PARP1-Timeless复合物的形成抑制DNA同源重组,降低基因组稳定性,促进肿瘤的形成。目前尚不清楚cGAS是否参与调控NSCLC细胞吉非替尼耐药,拟进一步设计实验进行论证。方法:体外培养吉非替尼敏感的肺腺癌细胞株（PC-9）和吉非替尼耐药的肺腺癌细胞株（PC-9 GR）,使用蛋白免疫印迹法（WB）检测cGAS蛋白在不同细胞株中的表达情况。根据cGAS在PC-9和PC-9GR细胞中的差异表达情况,使用携带过表达cGAS基因的质粒（OV-cGAS）转染PC-9细胞,构建高表达cGAS的PC-9细胞（PC-9 OV-cGAS）和小干扰RNA（siRNA-cGAS）转染PC-9 GR细胞,构建低表达cGAS的PC-9 GR细胞（PC-9GR siRNA-cGAS）。使用CCK-8检测吉非替尼对肺癌细胞半抑制浓度（IC50）;流式细胞术检测细胞凋亡率,细胞划痕实验检测细胞迁移能力;Trans-well细胞体外侵袭实验检测细胞的侵袭能力;细胞平板克隆形成实验,检测细胞增殖能力;WB检测不同细胞株中cGAS、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9、Ki-67以及GAPDH的蛋白表达情况。结果:（1）与PC-9细胞相比,PC-9 GR细胞中cGAS蛋白表达量明显较高,而PARP1蛋白表达下降。（2）吉非替尼对PC-9 OV-cGAS细胞的IC50明显高于PC-9细胞;吉非替尼对PC-9 GR细胞的IC50明显高于PC-9GR siRNA-cGAS细胞。（3）吉非替尼诱导PC-9细胞凋亡明显高于PC-9 OV-cGAS细胞;吉非替尼诱导PC-9 GR细胞凋亡明显低于PC-9GR siRNA-cGAS细胞。（4）细胞划痕后,观察0h,6h,12h,24h,细胞迁移情况,发现PC-9 OV-cGAS细胞迁移能力明显强于PC-9细胞;而PC-9GR siRNA-cGAS细胞迁移能力明显弱于PC-9GR。（5）PC-9OV-cGAS细胞侵袭能力明显强于PC-9细胞;PC-9GR siRNA-cGAS细胞侵袭能力明显弱于PC-9GR。（6）PC-9 OV-cGAS细胞克隆增殖能力明显强于PC-9细胞;PC-9GR siRNA-cGAS细胞克隆增殖能力明显弱于PC-9GR。（7）将PC-9细胞中cGAS过表达,可显著抑制PARP1的表达;而将PC-9GR中cGAS沉默,可上调PARP1表达。（8）WB结果显示,与PC-9细胞相比,PC-9 OV-cGAS细胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达水平以及Bcl-2/BAX比率明显升高。结论:cGAS通过上调吉非替尼敏感的肺腺癌细胞（PC-9）的增殖、迁移、侵袭能力和抑制细胞凋亡,钝化PC-9对吉非替尼的敏感性。cGAS下调通过抑制吉非替尼耐药的肺腺癌细胞（PC-9 GR）增殖、迁移和侵袭和促进细胞凋亡,改善PC-9GR对吉非替尼的耐药性。cGAS参与调控肺腺癌细胞对吉非替尼的耐药过程。