低分子柑橘果胶抑制HepG2和MCF-7细胞增殖及其机制的初步研究

作     者：吴晓倩 

作者单位：中国计量大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘明启

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 071001[理学-植物学] 07[理学] 

主      题：低分子柑橘果胶（LCP） 肝癌 乳腺癌 细胞凋亡 细胞周期 荧光光谱 分子动力学模拟 

摘      要：近年来,低分子柑橘果胶（LCP,Low-molecular Citrus Pectin）因其在医学和生物领域的潜在应用而受到广泛关注。实验室前期利用重组枯草芽孢杆菌果胶酸裂解酶（re Pel B）水解柑橘果胶制备得到LCP,本研究测定酶法制备的LCP的分子量和单糖组成,并将其作用于HepG2肝癌细胞和MCF-7乳腺癌细胞,主要实验结果如下:1.采用高效液相色谱法测得CP和酶法制备的LCP的分子量分别为140和7.6k Da,LCP的分子量比CP降低了94.6%;通过PMP柱前衍生化-HPLC测得CP与LCP单糖组分无显著差异,但是LCP的半乳糖醛酸含量比CP的高34.7%。2.通过CCK-8（cell counting kit-8）检测细胞生长率,发现LCP可以剂量依赖性抑制HepG2肝癌细胞和MCF-7乳腺癌细胞的增殖;通过TUNEL、流式细胞仪Annexin V-FITC双染色、JC-1检测发现LCP可以诱导HepG2和MCF-7发生凋亡。荧光定量PCR和Western Blot分析结果表明,经过LCP处理后,两种细胞的P-Akt、P-Erk1蛋白表达下降,PTEN表达上升。Bax、Caspase-3、PTEN、P53的m RNA表达水平上升,Bcl-2的表达水平下降。由此说明LCP介导了Akt/PTEN、Erk信号通路来调控两种癌细胞的增殖。3.通过流式细胞术检测LCP对细胞周期的影响,发现LCP诱导HepG2在S期发生阻滞,伴随的是该时期的CDK1（cyclin-dependent kinases）和细胞周期蛋白A1表达下降,而MCF-7则在G2/M期发生细胞阻滞,相应的CDK2和细胞周期蛋白B1表达下降,由此可见LCP通过调控不同的细胞周期相关蛋白来诱导两种细胞停滞在不同的细胞周期,但都是通过调控P21、P27蛋白的上调来起作用的。另外,我们还发现LCP可使HepG2和MCF-7细胞粘附能力下降且与细胞粘附能力蛋白Galectin-3（Gal-3）、CD44表达水平下降。4.Gal-3的碳水化合物识别结构域（carbohydrate recognition domain,CRD）可与多种半乳糖苷类似物作用。LCP富含半乳糖醛酸,但聚合度和分子量较大,且结构较复杂。因此以纯度高、结构明确的半乳糖醛酸三糖（Sigma标准品）与重组人Gal-3蛋白为实验材料,基于内源荧光光谱和分子模拟探究二者相互作用。内源荧光光谱分析结果表明,重组人Gal-3与半乳糖醛酸三糖（Tri）作用产生静态荧光淬灭;利用Auto Dock Vina对CRD与Tri进行分子对接,并对CRD-Tri复合物进行分子动力学模拟（molecular dynamics simulations）和非共价相互作用（non-covalent interaction）分析。分子模拟结果表明,配体半乳糖醛酸三糖与CRD上的R144、R162、N174和W181氨基酸残基间具有较强的氢键作用;MM/PBSA计算结果表明,CRD-Tri复合物的为结合自由能为-6.21±2.942 kcal/mol。本研究为酶法制备的LCP成为潜在的抗肝癌和乳腺癌功能食品提供了部分实验依据和参考。