影响新城疫病毒感染的miRNA-mRNA关键轴筛选及其分子机制研究

作     者：成姗育 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：尹仁福

授予年度：2022年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：新城疫病毒 miRNA表达谱 mRNA表达谱 miRNA-mRNA 

摘      要：新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒株感染导致的一种高度接触性的烈性传染病,可感染至少250种鸟类,其中包括家禽、水禽、野鸟等。通常,NDV强毒株感染可引起禽类出现高热、呼吸道症状、神经症状以及消化道出血性损伤等典型症状,对易感禽的致死率高达100%;而弱毒感染仅引起轻微呼吸道症状、生长缓慢、产蛋下降等非典型症状,一般可较快恢复。因此,NDV弱毒株(如La Sota毒株)作为疫苗被广泛用于临床上ND防控。micro RNA(miRNA)是一类长度约21～23 nt的内源性小RNA,广泛存在于多种真核生物中,也在一些DNA和RNA病毒中被发现。miRNA的作用方式主要是通过自身序列与其靶基因互补结合,造成靶mRNA降解或翻译抑制,从而调控下游靶基因表达。宿主miRNA已被证明能够参与病毒感染等多种生物学过程,调控转录后基因表达,而mRNA作为miRNA的下游分子,可充当效应分子直接参与病毒感染或宿主抗病毒免疫等多个环节。因此,利用高通量测序技术揭示NDV感染过程中miRNA和mRNA表达谱的变化,并对差异表达的miRNA和mRNA分子进行关联分析,筛选出NDV感染过程中功能性的miRNA-mRNA关键轴,进而探究关键轴在NDV感染过程中的调控作用,为进一步阐明NDV与宿主间互作机制提供新的见解,也可为制定新的ND防控策略提供理论参考。本研究分为以下三个部分:1.新城疫病毒感染鸡胚内脏组织过程中的差异miRNA表达谱分析本研究分别以7×10 TCID50病毒量的NDV强毒株NA-1(基因Ⅶ型)和弱毒La Sota株(基因Ⅱ型)感染10日龄SPF鸡胚,对照组接种等体积的PBS。分别于感染后12 h、24 h、36 h和48 h收取鸡胚尿囊液及内脏组织,并测定各时间点所收获鸡胚尿囊液的血凝效价。最终选择NDV强、弱毒株感染24 h和36 h组别中有血凝效价的鸡胚内脏组织样品进行miRNA高通量测序。结果显示:与未感染组相比,NDV感染后24 h,强毒NA-1组共有37个miRNA呈现差异表达,其中10个上调,27个下调;而弱毒La Sota组共有20个miRNA呈现差异表达,其中12个上调,8个下调。病毒感染后36 h,强毒NA-1组共有52个miRNA呈现差异表达,其中30个上调,22个下调;而弱毒La Sota组有共46个miRNA呈现差异表达,其中21个上调,25个下调。随机选取6个差异miRNA进行表达趋势验证,结果与高通量测序结果基本一致。进一步利用生物信息学技术预测差异表达miRNA的靶基因,并对靶基因进行功能注释后发现靶基因主要集中于细胞代谢、信号转导及免疫反应等方面,大量参与抗原加工和呈递、细胞因子相关信号通路等。2.新城疫病毒感染鸡胚内脏组织过程中的差异mRNA表达谱分析利用转录组测序技术对NDV强、弱毒感染后的鸡胚内脏组织中的mRNA表达谱进行分析,筛选出两种病毒感染前、后差异表达的mRNA,结果发现NDV感染24 h后,NA-1组有8,868个(上调4,075个,下调4,793个)差异表达的mRNA;而La Sota组有8,552个(上调4,079个,下调4,473个)差异表达的mRNA。感染36 h后,NA-1组有10,996个(上调4,755个,下调6,241个)差异表达的mRNA,而La Sota组有9,419个(上调3,937个,下调5,482个)差异表达的mRNA。进一步分析同一毒株感染后不同时间点的差异mRNA的共有表达情况,发现2,815个mRNA(16.5%)在NA-1感染后24 h和36 h为共有差异表达,2,574个mRNA(16.7%)在La Sota感染后24 h和36 h为共有差异表达。随机选取7个差异mRNA进行表达水平验证,结果与高通量测序结果基本一致。对各比较组差异表达mRNA进行功能注释发现其主要参与分子结合、催化活性以及生物调控等方面,并且这些差异基因大量参与抗病毒免疫相关信号通路以及PI3K-Akt信号通路、PPAR信号通路等代谢相关通路。进一步对不同组别差异表达的miRNA以及感染后24 h和36 h共有的mRNA进行关联分析,共筛选出95个与NDV感染或宿主免疫相关的miRNA-mRNA作用对,最终选定gga-miR-1648-5p-PDE4B作用对为研究对象,进一步验证两者间的靶向调控关系,初步探究gga-miR-1648-5p与PDE4B作用对在NDV感染过程中所发挥的调控功能。3.新城疫病毒弱毒疫苗株感染过程中候选miRNA-mRNA靶向关系验证及功能分析为探索gga-miR-1648-5p能否通过靶向PDE4B基因进而在NDV感染过程中发挥调控作用,首先利用q PCR检测gga-miR-1648-5p和PDE4B基因的表达水平,发现La Sota感染鸡胚内脏组织24 h后,gga-miR-1648-5p呈现显著下调表达,同时PDE4B在感染后24 h到36 h呈现持续性的上调表达,符合miRNA与mRNA负相关表达的规律。接着在细胞水平上转染gga-miR-1648-5p的模拟物、抑制物和突变体,发现gga-miR-1648-5p表达量的变化均可负向调控PDE4B表达,表明二者之间存在靶向调控关系。后续,利用si RNA干扰技术沉默HD11细胞中PDE4B基因的表达,探究其对La Sota感染过程中相关细胞因子(TNF-α、IL-1β)表达及病毒载量的影响。结果发现,PDE4B基因的沉默能显著下调TNF-α和IL-1β的表达,并显著增加细胞中病毒载量。最终通过在细胞水平上转染gga-miR-1648-5p的模拟物和抑制物来探究gga-miR-1648-5p能否通过靶向PDE4B来参与NDV感染过程。结果发现,转染gga-miR-1648-5p的模拟物能够显著下调PDE4B表达,并且其下游的TNF-α和IL-1β也呈现下调表达趋势,最终显著增加HD11细胞中病毒载量;而转染gga-miR-1648-5p的抑制物时,细胞因子TNF-α和IL-1β则呈现上调趋势且胞内的病毒载量减少。综上所述,这些结果均验证了gga-miR-1648-5p-PDE4B作用对通过两者间的靶向调控作用,影响了宿主TNF-α、IL-1β等炎性因子的表达,从而参与了NDV弱毒La Sota株的感染过程。