Cav-3/ERK1/2通路在吗啡预处理减轻心衰大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制研究

作     者：郭成晓 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张野

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100217[医学-麻醉学] 10[医学] 

主      题：吗啡预处理 慢性心力衰竭 缺血/再灌注损伤 小窝蛋白-3 细胞外调节蛋白激酶 

摘      要：背景慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是多种心脏疾病的终末阶段,具有发病率高、预后差,医疗费用高昂等特点。临床研究表明,手术治疗可能是提高缺血性心脏病及心瓣膜病等慢性心力衰竭患者远期生存率的最有效手段之一。然而,当这类病人行心脏手术时,将不可避免地经历心肌缺血与再灌注过程。研究表明,合并慢性心衰的患者,在体外循环下行心脏手术时,心脏更容易发生缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤,即使在行非心脏手术时,由于术中血流动力学可能出现的剧烈变化也会引起心肌功能的损伤,造成心肌顿抑,进而影响围术期病人的生存率以及患者的远期预后。缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)是经典的内源性心肌保护措施之一,阿片受体是IPC发挥心肌保护作用的重要作用靶点。在正常心脏中,阿片类药物预处理可通过激活阿片受体模拟IPC的心肌保护作用,但在高龄及糖尿病等病理状态下,心肌对包括IPC以及阿片药物预处理等保护措施的敏感性显著减弱或消失。尽管如此,系列地临床研究表明阿片类药物仍可以有效预防心力衰竭后心脏缺血后损伤,降低慢性心力衰竭患者心血管相关事件发生率。本课题前期研究发现,阿片类药物预处理减轻慢性心衰大鼠心肌的缺血再灌注损伤的机制与慢性心衰心脏中μ阿片受体(mu-opioid receptor,MOR)表达上调,并通过调节ERK-GSK3β信号通路有关。研究表明,阿片受体主要位于细胞膜的微囊部分,特别是与微囊上特征性微囊蛋白-3(Cav-3)存在密切关联。阿片受体介导的心肌保护作用依赖于Cav-3的表达,当体内Cav-3过表达,可以显著增强阿片预处理的心肌保护作用;而敲除Cav-3基因后,阿片预处理则不能有效激活ERK等蛋白激酶,继而减轻缺血后心肌的再灌注损伤。吗啡作为经典的阿片类镇痛药物,广泛应用于心血管手术中,发挥镇痛、镇静作用,同时也可减轻心脏负荷及心肌缺血后再灌注损伤。但Cav-3是否参与介导吗啡预处理减轻心衰心脏缺血后再灌注损伤及其作用机制仍不明确?本研究利用梗死后慢性心力衰竭大鼠,通过建立离体全心缺血再灌注损伤模型,联合心肌原位腺病毒注射及多种分子病理学等实验探讨Cav-3/ERK1/2在吗啡预处理减轻慢性心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制。方法1.慢性心力衰竭模型的制备和腺相关病毒心脏原位注射健康成年雄性大鼠,体重200-250 g,通过结扎冠状动脉左前降支制备慢性心力衰竭模型。另取部分大鼠于冠状动脉左前降支结扎后于左心室壁原位注射AAV9-Cav3sh RNA-GFP和AAV9-GFP,饲养4周后用于进一步研究。2.离体心脏全心缺血再灌注损伤模型的建立取慢性心力衰竭模型制备成功的大鼠心脏,快速悬挂于Langendorff灌注架上,逆行灌注K-H液。在平衡15 min后,心脏予以全心停止K-H液灌注30 min后再恢复灌注120 min制备离体心脏全心缺血再灌注模型。3.实验分组及处理慢性心力衰竭大鼠心脏55个,采用随机数字表法分5组(n=11):对照组(Sham组)、心肌缺血再灌注组(IR组)、吗啡预处理组(MPC组)、吗啡预处理+甲基-β-环糊精组(MPC+MβCD组)、甲基-β-环糊精对照组(MβCD组)。Sham组给予持续灌注K-H液。MPC组于平衡灌注15 min后灌注含1μmol/L吗啡的K-H液进行预处理,灌注5 min后改为K-H液灌注5 min,3个循环共计30 min,随后建立IR模型。MPC+MβCD组于吗啡预处理前10 min灌注含200μmol/L甲基-β-环糊精的K-H液,其余操作同MPC组。MβCD组:于全心缺血前40 min灌注含200μmol/L甲基-β-环糊精的K-H液,其余操作同IR组。另取注射AAV9-Cav3sh RNA-GFP和AAV9-GFP的慢性心力衰竭大鼠心脏22个(n=11),分别实施1μmol/L吗啡预处理,处理结束后建立IR模型。4.指标检测于平衡15 min末、再灌注5与10 min时收集冠状动脉流出液,采用化学比色法检测LDH活性。再灌注120 min末留取心脏行TTC染色,测定心肌梗死体积(IS)、缺血危险区体积(AAR),计算IS/AAR;采用TUNEL染色法检测细胞凋亡;提取再灌注末的心肌组织,采用Western blot法检测心肌组织Cav-3、ERK1/2、p-ERK1/2表达水平,计算p-ERK1/2/ERK1/2比值。结果1.慢性心力衰竭模型与离体心脏全心缺血再灌注损伤模型的评估与同期正常大鼠心脏相比,心衰组大鼠左心室心腔明显扩大,左心室收缩期/舒张期心腔内径显著增加,EF下降约45%(P0.05),表明慢性心力衰竭模型制备成功。在全心缺血再灌注损伤模型中,IR组较s