利用木糖产乙醇酵母菌的ARTP诱变选育及应用研究

作     者：张立钊 

作者单位：湖南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈力力

授予年度：2020年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083201[工学-食品科学] 

主      题：ARTP诱变 酵母菌 油茶籽 木糖 乙醇 

摘      要：植物纤维资源是最具潜力的乙醇生产原料,也是一种丰富的生物质资源,但是目前除少量用于纺织、造纸、建筑等行业,或用作薪柴(热效率仅为10%左右)、粗饲料,另外相当大一部分未能得到充分利用。植物纤维水解产物更多的以低聚木糖或木糖的形式存在,易于被微生物利用,经微生物发酵产生代谢产物,并可将其转化为乙醇或其他高附加值、多元化的产品。研究报道自然界中有少数种类的酵母菌能够利用木糖产乙醇,然而野生酵母乙醇产率低。近年来发展的常压室温等离子体(ARTP)诱变育种技术,由于集合了电子、离子、光子、激发态中性粒子、自由基、紫外辐射等诸多可能的生物诱变因素,因而在生物育种方面显示出了较大的应用潜力。本研究在自然分离筛选酵母菌株的基础上,着力于应用新型ARTP诱变育种技术选育利用木糖且发酵高产乙醇的优良酵母菌菌株,并以此作为生产菌种,木糖提取液为原料进行乙醇发酵试验,对其应用效果加以验证。以期获得优良菌株高效利用木糖,提升农副产品的利用率以及附加值,进一步开发新产品。笔者为此开展了相关研究工作,主要结果如下:(1)利用木糖产乙醇酵母菌的分离、筛选及鉴定从多种样品中分离得到利用木糖产乙醇酵母菌126株,通过采用多种方式比较其发酵产乙醇能力,得到5株乙醇产量相对较高的野生酵母菌A25、A42、A64、A70、A95。其中乙醇产量最高的为A42,28℃,160 r/min条件下发酵60 h乙醇含量为13.93 g/L。对5株分离菌株进行形态学及分子生物学鉴定可知,它们分别为季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii,A25)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus,A42)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus,A64)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus,A70)和异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus,A95)。比较5个菌株的特性,选取A25、A42进行后续试验。(2)A25、A42菌株的ARTP诱变选育对季也蒙毕赤酵母A25、异常威克汉姆酵母A42进行驯化培养,驯化后的A25、A42酵母菌菌株发酵的乙醇含量分别提高了15.06%、17.58%。通过ARTP诱变处理条件的探究,确定菌悬液浓度数量级10个/m L、诱变处理时间120 s为最佳诱变条件,在该条件下对两株酵母菌菌株A25、A42进行诱变,此时致死率分别达到95.00%、97.53%。随后,对分离的1000个突变菌株,采用杜氏小管发酵法和TTC比色法进行两轮筛选,对保留的57个突变菌株进行液态发酵,采用气相色谱法测定代谢产物乙醇含量并进行比较,最后筛选得到乙醇产量最高的菌株A25-55和A42-338,其乙醇产量分别为16.58±0.38 g/L和20.65±0.15 g/L,较亲本菌株分别提高了50.27%、41.75%。最终以异常威克汉姆酵母A42-338(Wickerhamomyces anomalus,A42-338)为本研究筛选得到的目标菌株开展遗传稳定性试验,且传代8次各代乙醇产量变化率不超过2%,具有较好的遗传稳定性。(3)异常威克汉姆酵母A42-338的应用研究首先采用响应面法开展了酶法处理油茶籽壳制备木糖提取液工艺的优化,最终优化的酶解条件为木聚糖酶添加量5%、酶解时间10 h、酶解温度49℃、底物浓度20 g/L。此优化条件下,木糖浓度为11.63 g/L,葡萄糖浓度为3.32 g/L。通过油茶籽壳木糖提取液与葡萄糖配比优化试验,将木糖提取液用葡萄糖复配成木糖:葡萄糖为1:3 g/g的发酵培养基,接种异常威克汉姆酵母A42-338的种子液,28℃,160r/min发酵60h乙醇产量最高,其乙醇含量为19.88 g/L,还原糖残糖含量为9.06 g/L,其中木糖残糖含量为1.79 g/L,葡萄糖残糖含量为7.27 g/L,木糖利用率为84.61%,葡萄糖利用率为81.05%,糖转化率为0.3976 g乙醇/g糖。异常威克汉姆酵母A42-338能应用于油茶籽壳木糖提取液及葡萄糖的混合糖乙醇发酵生产。